Страница 8 из 27
Биологические свойства ВПГ. ВПГ-1 и ВПГ-2 относятся к – герпетическим вирусам. Вирион ВПГ имеет капсид в форме иксаэдра 110 – 120 нм в диаметре. Капсид состоит из 162 капсомеров, окружающих сердцевину вириона, содержащую ДНК в виде двойной цепи. Электронная микроскопия не показала различий в форме вириона по сравнению с другими герпетическими вирусами (цитомегалии, Эпштейн – Барра, варицеллазостер). В строении ДНК ВПГ-1 и ВПГ-2 наблюдается одинаковая последовательность оснований, достигающая 40 %, что определяет сходство основных характеристик, включая антигенные. Различия в строении антигенов двух типов вируса главным образом заключаются в строении гликопротеина g, что трудно использовать для дифференцирования в условиях диагностических лабораторий, но возможно – в научно-исследовательских целях (вестерн-блот, иммуноферментный дот).
Лабораторная диагностика. Материалом для диагностики служит жидкость из пузырьков, если они есть, а также с тех мест кожи и слизистых, где ранее были поражения. Рекомендуется энергично протирать тампоном место поражения так, чтобы в исследуемый материал попали клетки эпителия. Обычно в лабораторию доставляют мазки, взятые из цервикального канала, из уретры. У новорожденных детей с диссеминированной формой заболевания исследуют спинномозговую жидкость, лейкоциты периферической крови, в случаях, угрожающих жизни ребенка (энцефалит), – биоптаты мозга, одновременно с началом терапии.
Наилучшие результаты дает культуральный метод исследования – заражение клеточной культуры. Могут использоваться как первично трипсинизированные фибробласты человека, так и диплоидные перевиваемые линии легочных фибробластов человека. Менее успешно использование клеточных линий Hep-2, Vero. Процедура заражения предусматривает 1-часовой контакт исследуемого материала с клеточным пластом для адсорбции вируса, затем удаление оставшегося материала и внесение поддерживающей среды. Заражают несколько пробирок с культурой клеток, в одной или нескольких из них клетки выращены на покровных стеклах.
Цитопатическое действие вируса зависит от количества вируса во внесенном материале. Оно проявляется быстро, в первые 24 ч после заражения клеток. Просмотр клеточного пласта (малое увеличение микроскопа) обнаруживает очаги увеличенных баллонирующих клеток, образование гигантских многоядерных слившихся в синцитий клеток. Из пробирок достают покровные стекла, фиксируют холодным ацетоном и обрабатывают моноклональными антигерпетическими антителами. Микроскопия в люминесцентном микроскопе позволяет выявить антигены ВПГ в виде внутриядерных светящихся включений. Применение метода дает результат в первые 48 ч. Можно также использовать иммуноферментный анализ для поиска герпетического антигена в лизате клеток зараженной культуры, снятой трипсином со стекла. Чувствительность и специфичность метода – от 70 до 95 %. Его применение не всегда успешно при бессимптомной инфекции.
Для выявления вируса в зараженной клеточной культуре применяют также метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Молекулярно-биологические методы могут использоваться и при исследовании первичных материалов, взятых у больных. Гибридизация ДНК позволяет обнаруживать ДНК ВПГ с помощью радиоактивной метки. За последние годы довольно широкое распространение получили методы, использующие амплификацию специфических участков ДНК вируса простого герпеса. Многие зарубежные и отечественные фирмы выпускают наборы реактивов и аппаратуры для проведения ПЦР как диагностического метода. В их числе наборы АО «Биосервис», «ЛИТЕХ», НПО «Вектор», фирмы «Abbott», «Sanof-Pasteur».
УРОГЕНИТАЛЬНЫЙ ХЛАМИДИОЗ
Среди большого числа инфекций, передаваемых половым путем, урогенитальный хламидиоз является одним из самых распространенных. Его роль в развитии воспалительных заболеваний мочеполовых органов у мужчин и женщин, в возникновении бесплодия у женщин, патологии беременности и родов, в возникновении назофарингитов, бронхитов, пневмоний, конъюнктивитов у новорожденных весьма значительна.
Хламидии являются бактериями с характерной для прокариот структурой. Это мелкие грамотрицательные микроорганизмы, которые составляют группу облигатных внутриклеточных паразитов, неспособных размножаться вне клетки организма-хозяина. Наибольший тропизм хламидии проявляют к клеткам цилиндрического эпителия. Цикл развития хламидий уникален и включает д в е формысуществования микроорганизма: элементарные тельца (ЭТ) – мелкие неподвижные сферические организмы размером 0,15 – 0,20 мкм – и ретикулярные тельца (РТ) – более крупные, около 1 мкм. ЭТ представляют собой инфекционную форму возбудителя, адаптированную к внеклеточному существованию. РТ являются вегетативной неинфекционной формой внутриклеточного развития хламидий.
В настоящее время различают 15 сероваров C. trachomatis. Так называемые «глазные» штаммы (A, B, Ba, C) вызывают классическую эндемическую трахому, передаются от человека человеку при прямом контакте. Серовары D…K поражают различные отделы урогенитального тракта и передаются половым путем. Новорожденные дети инфицируются при прохождении через инфицированные родовые пути. Серовары L1, L2, L3 являются возбудителями венерической лимфогранулемы.
Лабораторная диагностика. Диагноз урогенитального хламидиоза основывается на данных анамнеза, клинической картине и подтверждается результатами микробиологических исследований. Качество взятия биоматериала, дальнейшая его обработка и хранение имеют важное значение для получения достоверных результатов. Необходимо соблюдать следующие правила:
– перед взятием материала из уретры рекомендуется задержка мочеиспускания в течение полутора – двух часов;
– гнойные выделения следует удалить ватным тампоном, после чего взять соскоб эпителия;
– соскоб рекомендуется брать специальным разовым зондом, в исключительных случаях ложкой Фолькмана;
– в уретру мужчин зонд вводят на глубину 3 – 4 см, в уретру женщин – на 1 – 1,5 см, у детей материал берут с наружного отверстия уретры;
– из цервикального канала удаляют слизистую пробку, зонд вводят в канал шейки матки на глубину 0,5 – 1,5 см, при извлечении зонда исключить касание стенок влагалища;
– у новорожденных детей берут пробы с конъюнктивы века, задней стенки глотки, из вульвы, у мальчиков – мочу;
– кровь на наличие антител берут при выраженных общих проявлениях инфекции (обострение сальпингита, простатита, болезни Рейтера и т. п.).
Для диагностики урогенитального хламидиоза в настоящее время используют следующие методы:
• культуральный;
• иммунофлюоресцентный;
• иммуноферментный;
• молекулярно-биологический;
• серологический.
Культуральный метод. Этот метод считают «золотым стандартом», с которым сравнивают специфичность и чувствительность других методов. Для выделения хламидий используют клеточные линии, в которых хламидии могут размножаться – mcCoy, z-929, ВНК-21, HeZa 229. Клетки выращивают в среде 199 с добавлением 10 % сыворотки крови крупного рогатого скота. Суспензия клеток, содержащая 2105клеток в 1 мл среды, разливается в плоскодонные пробирки, пенициллиновые флаконы или в лунки плоскодонного планшета, в которые опускаются покровные стекла размером 7 7 мм. Монослой формируют при вертикальном положении пробирок в течение 24 ч при температуре 37 C. Через сутки среда сливается, а монослой клеток обрабатывается высокомолекулярными декстранами за 30 мин до заражения или циклогексимидом в дозе 1 – 2 мкг/мл. В пробирки с обработанным монослоем клеток вносят исследуемый материал и проводят центрифугирование для осаждения инокулята на монослой. Центрифугируют в центрифуге с горизонтальным ротором при 2500 – 3000 об./мин в течение 1 ч. После центрифугирования пробирки инкубируют 2 ч при температуре 37 C, затем инокулят удаляют, в пробирки вносят поддерживающую среду с антибиотиками и сниженным количеством сыворотки (5 %). Зараженные культуры помещаются в термостат на 48 – 72 ч, далее среда отсасывается, монослой промывается буфером, стекла вынимаются, подсушиваются и окрашиваются, одно по Маю – Грюнвальду – Гимзе, второе – моноклональными антителами. Положительный результат регистрируют по обнаружению в клетках ярко светящихся микроколоний хламидий на красно-коричневом фоне цитоплазмы. Контрастный яркозеленый свет включений хорошо различим при люминесцентном микроскопировании.