Страница 112 из 371
Обязательно проверьте внутреннюю поверхность крышки на чистоту перед каждым использованием (это относится и к резьбе на банке). Следы старого субстрата на горле банки или внутри крышки могут вызвать большие проблемы. Пятна ржавчины на внутренней стороне крышек также могут удерживать частицы субстрата и обеспечивать условия для роста микробов.
Замечу, что добавление перекиси делает необязательным установку на крышках микропористых фильтров, как этого требуют традиционные методы. Тем не менее, крышки на банках являются уязвимым местом, даже при добавлении к среде перекиси, потому что вам придется перетряхивать банки для распределения мицелия, а при перетряхивании споры, которые диффундировали на внутреннюю поверхность крышки из воздуха (или фрагменты плесени, которые выросли в микроуглублениях на плохо отмытой крышке) могут войти в контакт с мицелием, который сам по себе не защищен. Чтобы исправить этот недостаток, присущий крышкам, я делаю следующее:
1. Приготовляю набор тонких картонных дисков, вырезанных по внутреннему размеру крышек (хорошо подходит картон от какой-нибудь коробки; просто очертите крышку на картоне при помощи ручки, а затем вырежьте по внутренней стороне круга, слегка к центру от линии).
2. В случае с субстратом-«десятиминуткой», я смешиваю ингредиенты, используя отдельную крышку, а затем, перед обработкой паром, устанавливаю крышки с картонными дисками на место.
3. После охлаждения субстрата я открываю крышки и смешиваю картонные диски 3 % раствором перекиси, наливая его в крышки слоем в 1–2 мм. Увлажненные перекисью крышки формируют затем барьер для источников заражения, находящихся в воздухе.
В случае с зерном или другим субстратом, требующим стерилизации, я заворачиваю крышки с картонными дисками в алюминиевую фольгу и стерилизую их отдельно от банок с субстратом, которые на время стерилизации закрыты отдельными крышками. Затем, после добавления перекиси в стерилизованный субстрат и распределения путем перетряхивания, я снимаю временные крышки и устанавливаю на место стерильные крышки с картонными дисками. После этого, я увлажняю диски 3 % раствором перекиси.
Инокуляция субстрата
Стерильные контейнеры с субстратом могут быть инокулированы двумя способами. Вы можете вырезать кусочки мицелия из агаровой культуры с помощью стерильного скальпеля и бросить их в контейнеры (Если вы изберете этот метод, то сперва встряхните банку или пакет, чтобы субстрат пересыпался на одну сторону. Таким образом вы можете поместить кусочек мицелия вглубь субстрата, но он при этом окажется у стенки контейнера и за ним можно будет наблюдать). Или вы можете перетрясти контейнер после добавления мицелия. Я предпочитаю не перетряхивать контейнер — это часто заканчивается тем, что кусочки агара прилипают к стенке в месте над субстратом. Это место не защищено перекисью, а стряхнуть агар посредством дальнейшего встряхивания банки затруднительно. К тому же, перетряхивание субстрата с перекисью не дает очевидных преимуществ. Небольшие фрагменты мицелия, которые отделяются при перетряхивании, вероятно, слишком малы для того, чтобы эффективно адаптироваться и продолжить свой рост в присутствии перекиси, концентрация которого при использовании в посевном субстрате достаточно велика. Поэтому я бросаю кусочки агара (для медленно растущих штаммов — по три кусочка) вглубь субстрата и закрываю контейнер. В случае с опилочным субстратом для Н. erinaceus я дополнительно уплотняю субстрат, постукивая банкой о стол, чтобы субстрат охватил кусочки агара, потому что этот вид, похоже, предпочитает субстрат плотной, утрясенной консистенции.
Заметьте, что для инокуляции субстрата с перекисью следует использовать только адаптированный к перекиси мицелий, т. е. мицелий, выращенный на перекисесодержащем агаре. В противном случае, не адаптированный мицелий может погибнуть, или же для начала его роста потребуется слишком много времени, т. к. мицелий столкнется с перекисью в относительно высокой концентрации, которая обусловлена предлагаемой рецептурой для посевного субстрата. Вместе с тем, основной субстрат с перекисью содержит последнюю в гораздо меньшей концентрации и поэтому может быть безопасно инокулирован посевным мицелием, не адаптированным к перекиси.
Первоначально я помещал банки после инокуляции в свежие пластиковые пакеты, завязывая их на узел (я делал это немедленно после протирания банок спиртом). Я использовал пластиковые пакеты для того, чтобы обеспечить неподвижность окружающего банки воздуха и уберечь банки от приблудившихся грибных комариков (пакеты можно использовать повторно, если они не загрязнены). Позже я стал помещать банки на инкубацию без пакетов и это не оказало на конечный результат никакого отрицательного влияния.
В заключение я удостоверяюсь, что банки закрыты должным образом и оставляю их на несколько дней, пока мицелий не начнет осваивать окружающее пространство. Разлагающаяся перекись обеспечивает мицелий кислородом, поддерживая его рост на этом этапе, а уровень углекислого газа в это время еще не слишком высок. Когда ореол мицелия достигает сантиметра в поперечнике, я перетряхиваю субстрат. Через несколько дней в субстрате появляется множество новых точек роста (не затягивайте слишком с перетряхиванием субстрата, т. к. вместе с ростом ореола мицелия вокруг кусочка агара, количество перекиси, защищающего субстрат, постоянно уменьшается). Раньше я ослаблял крышку на банке после перетряхивания, чтобы обеспечить некоторый газообмен, но сейчас я считаю, что в этом нет необходимости. Картонный диск, очевидно, обеспечивает газообмен в достаточной степени, даже если крышка плотно закрыта.
Посевной мицелий готов к использованию, если он не очень плотно, но полностью освоил всю массу субстрата. Я обычно жду, когда мицелий начнет расти над поверхностью субстрата (на полсантиметра или более) и только после этого использую содержимое банки для инокуляции.
Если вы используете не банки, а пакеты с субстратом, порядок действий остается в основном тем же. Вам не нужно беспокоиться о попадании контаминантов в охлажденные пакеты, так как любые микроорганизмы, попавшие внутрь, будут уничтожены перекисью.
Что я думаю об использовании перекиси для приготовления жидких культур? Я не рассматривал такую возможность по двум причинам. Во-первых, любой метод инокуляции жидкой среды подразумевает перемешивание прививочного материала (или, в некоторых других способах, разламывание мицелия), что высвобождает в процессе инокуляции заметное количество перекисеразрушающих ферментов, попадающих в среду. Во-вторых, даже если предположить, что с первой проблемой можно справиться, я предвижу быстрое снижение концентрации перекиси в жидкой среде, потому что в ней будет циркулировать нетронутый грибной материал, содержащий внутри себя перекисеразрушающие ферменты. На твердых субстратах мицелий осваивает ограниченный участок, а концентрация перекиси на нетронутой среде остается на желаемом уровне. Уменьшение количества перекиси может быть восполнено ее регулярным добавлением, но это может потребовать методики измерения концентрации перекиси в очень разбавленных растворах.
Колонизация основного субстрата
Колонизация основных, плодоносящих субстратов — это третья стадия в процессе грибного культивирования, ведущая напрямую к производству съедобных грибов.
В связи с тем, что раствор перекиси так дешев, экономически выгодным является добавление достаточного количества перекисного раствора в плодоносящие субстраты, чтобы защитить их от заражений. С технической точки зрения это означает, что можно выращивать некоторые виды дереворазрушающих грибов без применения автоклавирования для стерилизации субстрата. С другой стороны, методики, о которых говорится в этом томе, предусматривают использование субстратов, не содержащих перекисеразрушающих ферментов. Перекись не даст заметных преимуществ (или не даст вовсе) на субстратах, которые все еще обладают значительной биологической активностью, таких, как компост, пастеризованная солома или свежие древесные опилки, обработанные в кипящей воде.