Страница 107 из 371
7. После добавления перекиси я немедленно перехожу к чашкам петри, которые к этому времени расставлены на чистом столе. Свободно разливаю среду в чашки, накрывая их крышками после заполнения агаром.
8. После того, как агар застынет, я убираю чашки на несколько дней на слегка прикрытый лоток, чтобы подсушить агаровую среду.
Агар, приготовленный без автоклавирования
Если у вас нет скороварки или вы не хотите ее использовать, вы все равно можете приготовить защищенные агаровые чашки путем кипячения или обработки паром агаровой среды. При этом придется несколько изменить рассмотренную выше рецептуру. Вам нужно будет заменить ингредиенты, содержащие перекисеразрушающие ферменты на другие ингредиенты, которые не содержат таких ферментов. В рассмотренных ранее рецептах агар, солод и гранулированные опилки не содержат перекисеразрушающих ферментов, а дрожжи, мука и корм для кроликов — содержат. Для того чтобы использовать агаровую среду, нам обычно приходится обрабатывать ее в скороварке, чтобы уничтожить перекисеразрушающие ферменты в этих ингредиентах. Тем не менее, указанные ингредиенты могут быть заменены на другие. Дрожжи служат источником витаминов, поэтому их можно заменить небольшим количеством свежего витаминного драже группы В. Поскольку витаминные препараты производят искусственным путем, они не содержат ферментов. Молотое зерно и кроличий корм являются источником белка, поэтому эти ингредиенты можно заменить на другие перекисесовместимые протеиновые добавки. В общем случае, только подвергнутые глубокой переработке субстанции не содержат перекисеразрушающих ферментов, например, желатин, соевое молоко, обезжиренное сухое молоко и т. п. Для того, чтобы проверить исследуемую добавку на наличие ферментов, смешайте небольшое ее количество с 3 % раствором перекиси и наблюдайте на появлением пузырьков. Отсутствие пузырьков означает отсутствие ферментов.
Вот рецепт для приготовления 1 литра агара без стерилизации в скороварке:
• 12 г агара
• 12 г мелко перемолотого солода
• 0.5 г источника азота (следует производить ротацию этого компонента, например: желатин, соевое молоко, сухое молоко и т. п.)
• 5–7 опилочных гранул
• небольшой кусочек витаминного драже группы В (0.1 г, ориентиром может служить появление легкой желтой окраски)
• 1л чистой воды, без каких-либо частиц
1. Прокипятите банку с этой средой (а также чашки петри) в кипящей воде в кастрюле, закрытой массивной крышкой, в течение примерно 45 минут, что позволит агару раствориться и уничтожит все живые организмы в среде (чашки петри можно стерилизовать даже дольше).
2. Выньте банку, дайте ей остыть и добавьте перекись, как в первом рецепте. Перекись убьет все споры, оставшиеся в среде. Я добавляю немного больше перекиси в неавтоклавированные чашки, примерно 8 мл на литр среды. Опыт показывает, что неавтоклавированные чашки в среднем подвергаются заражениям чаще, чем автоклавированные перекисные чашки, но и в этом случае результаты заметно лучше, чем при использовании чашек без перекиси.
Следите за образованием подтеков агаровой среды, которые остаются на внешней стороне чашек петри. Если их не вытирать, они через несколько дней покроются плесенью и затем споры плесени проникнут внутрь чашек и начнут прорастать на внешней кромке агара.
Если вы, как и я, работаете с чашками петри многократного использования, очищайте их тщательным образом от старого агара. Даже самое незначительное количество старого агара, оставшегося в чашке, если оно не контактирует с перекисью в свежем агаре, при последующем использовании чашки может обрасти плесенью и послужить своеобразным трамплином для последующего заражения.
Наполнение чашек охлажденной агаровой смесью дает определенное преимущество, которое заключается в заметно меньшем образовании конденсата на внутренней поверхности верхней чашки, чем при заливке горячей смеси. Совершенно очевидно, что в этом случае вам не придется принимать дополнительных мер по борьбе с конденсатом, таких как стряхивание капель с верхних чашек или подогревание чашек для испарения капель. Через более прозрачные чашки будет легче наблюдать за тем, что в них происходит. Тем не менее, поверхность агара все-таки требует некоторого подсушивания, поэтому я оставляю перед использованием открытые чашки на день при комнатной температуре, слегка прикрыв их пергаментной бумагой для защиты от пыли. Чашки с агаром, которые были обработаны паром, получаются более влажными, чем те, в которых агар был стерилизован в скороварке (т. к. температура обработки была ниже, а время обработки — меньше), поэтому их приходится подсушивать в течение более длительного времени.
Если после заполнения чашек у вас осталось некоторое количество неиспользованного агара, его можно сохранить в стерильном виде в холодильнике. Когда вы решите снова использовать его, вы можете повторно расплавить агар, но в этом случае вам также придется снова добавить в среду перекись, потому что нагрев агара до температуры плавления вызовет разрушение перекиси, добавленной в первый раз.
Приобретение грибных культур
Есть несколько путей приобретения грибного мицелия для дальнейшего выращивания на агаре. Можно прорастить грибные споры в питательной среде. Можно извлечь в асептических условиях ткань из свежего гриба и бережно перенести на агар для дальнейшего роста. Можно также купить грибную культуру у коммерческого поставщика, обычно в форме агара в пробирке или чашке петри.
В связи с тем, что перекисесодержащая питательная среда убивает грибные споры, я пока что не занимался проращиванием спор для получения грибной культуры. Напротив, я предпочитаю приобретать грибной мицелий у поставщиков с проверенной репутацией. Я смотрю на это следующим образом: поставщик уже проделал непростую работу по изоляции грибного штамма с нужными качествами и, покупая грибную культуру, я с достаточной степенью уверенности приобретаю мицелий, имеющий точно такие же качества. Для контраста, если вы пытаетесь вырастить грибной штамм, который был изолирован после проращивания спор или клонирования, и он не плодоносит, вы не будете знать, где сокрыты причины неудачи: в условиях роста или самом штамме (споры подобны семенам: их генетические характеристики могут совпадать с родительскими, а могут и не совпадать). Вы можете потратить массу времени впустую, пытаясь добиться плодоношения от бесполезного штамма. Более того, если вам удастся в заданных условиях изолировать культуру и вы по каким-то причинам потеряете ее, то, если культура не была приобретена у коммерческого поставщика, вы не сможете просто вернуться к поставщику и получить дополнительную «копию» штамма. Вам придется получить новый штамм, отвечающим определенным условиям.
Когда вы покупаете грибную культуру у коммерческого производителя, подразумевается, что эта культура будет использована для выращивания (и, если вы так решите, продажи) посевного мицелия, субстратных блоков или плодовых тел данного грибного штамма. Также подразумевается, что вы не будете использовать приобретенную культуру для организации собственного банка штаммов и продавать агаровые культуры другим с целью коммерции. Если вы хотите продавать агаровые культуры, то из соображений этики, вам нужно будет клонировать мицелий из дикорастущих образцов или получить его, проращивая споры.
Клонирование грибов
Как бы то ни было, клонирование собственной грибной культуры из диких образцов, собранных на природе, также может быть увлекательным. Возможно, вам удастся получить плодоносящий штамм первого порядка. Если вы захотите попробовать произвести клонирование, вам потребуются несколько чашек с перекисным м агаром (см. ниже), скальпель, спиртовка и свежий гриб.