Страница 106 из 371
2. Умножьте предыдущее значение на объем раствора перекиси, который вы добавили бы к среде или субстрату, если бы это был 3 % раствор (это значение приводится в соответствующих разделах этой книги; например в разделе, посвященном агаровой культуре, вам будет нужно добавить 6 мл 3 % перекиси к 1 л стерилизованной агаровой среды).
Информация о точной концентрации перекиси наиболее важна, когда вы приготовляете агаровые чашки (см. ниже), так как вам придется работать с концентрациями, которые близки к нижнему порогу эффективности. При изготовлении посевного мицелия вы будете иметь дело с заметно более высокими концентрациями, так что возможностей для вариаций будет больше. Для приготовления основного субстрата я использую меньше перекиси, чем для посевного мицелия, но и в этом случае остается некоторая свобода для подбора концентраций. Я рекомендую производить тест с шариком для каждой новой бутылки с раствором перекиси, который используется для работы с агаром а также проверять перекись, который используется для посевного и основного субстрата, если только вы полностью не уверены в надежности поставщика. Поступая, таким образом, вы будете совершенно уверены, что культура защищена настолько, насколько это ожидается. Не исключено, что вам придется провести исследование местного рынка и выбрать продавца, который предоставляет наиболее надежный продукт. Звучит парадоксально, но может оказаться, что самый дешевый вариант является также и самым лучшим, потому что регулярный оборот продукции на складе поставщика будет там, где перекись дешевле. Если перекись отсутствует в ваших местных магазинах, то есть смысл поискать его на фирмах, занимающихся поставкой химреагентов. Они зачастую предлагают 30 % или 35 % раствор перекиси, который можно затем развести. Магазины, обслуживающие бассейны, также могут предлагать перекись в подобной концентрации. Имейте в виду, однако, что столь концентрированные растворы гораздо более опасны, чем стандартный 3 % раствор. Прочтите все предупреждающие надписи на этикетке бутыли и соответствующе обращайтесь с этим раствором.
Выращивание агаровых культур и уход за ними
Первой стадией выращивания грибов является размножение грибной ткани (мицелия) на агаре в чашках петри и последующий уход за ней. Полученные первичные культуры используются для хранения, размножения и поддержания грибных штаммов в здоровом состоянии путем последовательных пересевов, а также для инокуляции вторичных культур — посевного мицелия.
Подготовка чашек петри.
Существует немало рецептов агаровых сред, которые могут быть использованы для выращивания грибного мицелия на чашках петри. Я испробовал некоторые из них, но в настоящее время использую только один: мальт-дрожжевой агар (солод-дрожевой агар, malt yest agar), известный также как MYA. Этот агар подходит практически для любого вида грибов, которые я пробовал выращивать. Данная среда не настолько питательна, чтобы немедленно подвергнуться заражению, хотя многие штаммы распространяются по чашке петри на MYA за две или три недели. По моему мнению, при использовании перекисных сред нет особой необходимости в более быстром росте мицелия, потому что быстрое зарастание среды заставит вас производить пересевы на новые чашки для того, чтобы сохранить мицелий свежим. Кроме того, после нескольких последовательных переносов мицелия из чашки в чашку могут возникнуть проблемы со старением (сенесценцией) мицелия и поэтому некоторые грибоводы рекомендуют в таких случаях начинать все заново, используя сохраненную эталонную культуру. Согласно такому подходу, чем быстрее мицелий растет, тем раньше его придется поместить на хранение, поэтому я бы предпочел мицелий, который растет относительно медленно.
Я работаю с культурами в чашках петри, которые растут на среде, содержащую перекись. Заражения на перекисных чашках случаются редко и при соблюдении некоторых мер предосторожности вам не придется покупать ламинарный шкаф или строить главбокс для того, чтобы оградиться от контаминантов. Вы можете наполнять чашки на открытом воздухе на кухне. Хранить и заращивать чашки можно где угодно, лишь бы это место было относительно чистым, а условия внешней среды были бы подходящими для роста мицелия. Тем не менее, обратите внимание на рекомендации в конце этого раздела.
Мальт-дрожжевой агар, MYA
Вот рецепт, который я использую для приготовления 1 литра мальт-дрожжевого агара:
• 12 г агара
• 12 г тонко размолотого солода
• 1 г пищевых дрожжей
• 0.5 г муки (у меня идет такая ротация сортов: пшеница, рожь, кукуруза, рис, овес, просо)
• 0.5 г кроличьего корма (или другого гранулированного корма для животных)
• 4–5 г гранулированных опилок (количество гранул может быть увеличено для дереворазрушающих видов грибов, которые хуже растут на агаре)
• 1л воды из-под крана
Если вы приобретаете в магазине готовую смесь для приготовления мальт-дрожжевого агара, то она, скорее всего, уже будет содержать первые три ингредиента: агар, солод и дрожжи. Остальные ингредиенты вы можете добавить самостоятельно. Сверьте по инструкции производителя, сколько смеси рекомендуется добавлять к 1 л воды. Обычно требуется примерно 40 или 50 грамм. В зависимости от количественного соотношения агара и солода, можно сократить количество смеси вдвое от рекомендованного и получить среду, которая лучше подходит для длительного и здорового роста мицелия.
Я приготавливаю агаровую среду для чашек в такой последовательности:
1. Смешиваю все ингредиенты в банке с необходимым количеством воды. Банка должна быть в два раза больше по объему, чем объем полученной среды, чтобы агар не выплескивался при закипании во время приготовления.
2. Корректирую pH среды, добавляя небольшое количество питьевой соды (моя вода является кислотной, но если у вас вода щелочная, то можно добавить немного уксуса. Смотрите также замечания об измерении pH субстрата в главе, посвященной приготовлению основного субстрата).
3. Стерилизую среду в скороварке, агар при этом растворяется. (Я использую воду из-под крана без всяких проблем. Более того, когда я растил мицелий на среде, приготовленной на дистиллированной воде, рост мицелия был заметно более медленным). Свободно накрываю банку крышкой и стерилизую в скороварке под давлением 1 атм. в течение не более 10 минут, предварительно дав агару разойтись в течение 10 минут перед тем как закрыть клапан давления. (Если вы приобрели готовую смесь для MYA-arapa, в инструкции к ней может быть указано значительно большее время стерилизации, например, 45 минут. Не делайте этого! 20 минут — это более, чем достаточно, а при дальнейшей стерилизации будут образовываться вредные для мицелия продукты карамелизации среды). Вместе со средой я стерилизую также и набор чашек петри, поместив их в большую консервную банку из-под томатов, накрытую фольгой (я использую пластиковые чашки петри многократного использования и одного литра агара хватает на то, чтобы наполнить около 30 чашек).
4. По окончании стерилизации я осторожно убираю скороварку с плиты и сбрасываю давление пара. Аккуратно вынимаю банку со средой и ставлю ее на стол остывать на открытом воздухе. Нет никакой необходимости беспокоиться о попадании в банку не стерильного воздуха, если воздух более-менее свободен от пылевых частиц. Контаминанты, попавшие в банку с воздухом, погибнут после добавления в среду перекиси.
5. Когда банка остынет и ее можно комфортно брать руками, я помещаю ее в кастрюлю с горячей водой, потому что при этой температуре агар уже близок к застыванию.
6. Добавляю раствор перекиси с помощью пастеризованной пипетки и быстро перемешиваю среду круговыми движениями банки, изменяя пару раз направление вращения. Я стараюсь избегать образования большого количества пузырьков, которые потом могут остаться на поверхности агара.