Страница 61 из 107
Сейчас вам нужно расположить рабочие материалы так, чтобы пробирка, пока вы помещаете в нее кусочек грибной ткани, как можно меньшее время оставалась открытой. Для того, чтобы вероятность заражения была минимальна, недопустимо класть пробирку или пробку на стол. Этот момент представляет некоторую сложность. Будет полезно сперва попрактиковаться с пустой пробиркой перед тем, как использовать "боевую" пробирку с агаром и грибную ткань. Дальнейшие указания подразумевают, что вы — правша. Если нет, то все придется делать в зеркальном порядке.
Держите левую руку так, чтобы большой палец смотрел вниз, а остальные пальцы были расположены горизонтально. Поместите пробирку между средним и безымянным пальцами левой руки так, чтобы безымянный палец был сверху, средний — снизу пробирки, а пробка смотрела в направлении от руки. Пробирку следует держать только в горизонтальном положении, чтобы частицы из воздуха не попадали в горлышко пробирки. Скошенная поверхность агара, на которую вы будете помещать грибную ткань, должна смотреть вверх. Осторожно снимите пробку с пробирки и поместите ее между безымянным пальцем и мизинцем так, чтобы мизинец был сверху, а безымянный палец — снизу. (См. Рис. 2).
Рис. 2 — Немного мудрёно, но практика помогает
Используя свободные указательный и большой палец левой руки, крепко возьмите кусочек гриба с чистой поверхностью, смотрящей вверх или вбок. Правой рукой уверенно возьмите скальпель, держа его за ручку наподобие карандаша. Кончиком лезвия отрежьте от чистой грибной ткани очень маленький кусочек треугольной формы. Осторожно отделите грибную ткань и быстро поместите внутрь пробирки на край горлышка. Если нужно, стряхните кусочек гриба со скальпеля постукивающими движениями. Положите скальпель на место и быстро закройте пробирку пробкой.
Теперь несколько раз постукайте нижней частью пробирки о тыльную сторону ладони для того, чтобы переместить грибную ткань на агаровую поверхность (См. Рис. 3). Поставьте пробирку в другую консервную банку, предназначенную для хранения инокулированных пробирок.
Рис. 3. — Перемещаем с помощью постукивания
Комментарий к тексту на рисунке: Move to Here by Tapping the Tube against the Heel of the Hand — переместите в это место путем постукивания пробиркой по тыльной стороне ладони, Insert Неге — поместите сюда
Есть! Теперь у нас имеются очень хорошие шансы на то, что полученная культура гриба является чистой.
Проделайте то же самое с оставшимися пробирками и грибным материалом. Изготовление нескольких пробирок с каждого образца гриба важно по той причине, что даже при самой аккуратной работе иногда случаются заражения.
После проведения инокуляции очередной пробирки простерилизуйте заново скальпель или лезвие ножа на пламени и оторвите свежий кусочек гриба, чтобы открыть другой участок чистой ткани грибного тела.
После того, как работа с пробирками завершена, закрутите плотнее колпачки и обверните на каждой пробирке место, на котором колпачок граничит со стеклом, при помощи микропористой ленты. Микропористая лента позволит культуре "дышать", но предотвратит попадание инородных организмов через горлышко пробирки. Пометьте пробирки перманентным маркером или небольшими наклейками, указав дату и информацию о содержимом.
Наконец, поместите инокулированные пробирки в темное и прохладное место (наилучшая температура 13–21 градусов по Цельсию). Через некоторое время (от нескольких дней до недели) грибная ткань станет пушистой, что связано с началом роста мицелия. Через несколько недель мицелий полностью покроет поверхность агара.
Если показалась плесень (ее легко распознать по спорам зеленого, черного или другого цвета) или бактериальное заражение (обычно окрашенная лоснящаяся субстанция), то эта культура подлежит немедленному уничтожению, а пробирки и пробки следует вымыть в горячей мыльной воде. По возможности, пробирки с зараженной культурой нужно освобождать в отдельном месте, подальше от здоровых культур. Например, выйдите на улицу и выбросите содержимое прямо в мусорный бак. Для освобождения пробирки от питательной среды можно использовать китайскую палочку для еды; среду можно извлечь сразу целым кусочком или по частям.
Шаг II: Методики стерильного переноса и зерновой мицелий
Стерильный перенос на ряд агаровых пробирок
Полученная агаровая пробирка, содержащая грибной мицелий, является "мастер-культурой" (маточной культурой). Если есть желание размножить культуру для того, чтобы иметь ее запас или чтобы поделиться с другими грибоводами, следует перенести грибной материал из одной пробирки в несколько других пробирок. Эту работу можно выполнить, используя точно такую же методику первоначального стерильного переноса, как это было описано выше.
Тем не менее, вместо использования фрагмента грибной ткани, взятого из плодового тела гриба, можно взять небольшой кусочек агара, содержащего мицелий из пробирки с маточной культурой. Перенос производится с помощью скальпеля или другого подходящего приспособления, например, инокуляционной петли, которую можно купить или изготовить самостоятельно из отрезка проволоки, прикрепленного к какой-нибудь ручке (См. Рис. 4. Прим. ред.: Это инструмент микробиологов, для микологии лучше подходит не петля, а крючок или "коготь" на рабочем конце стальной проволоки).
Рис. 4. — Простое приспособление
Комментарий к тексту на рисунке: Inoculation Loop — инокуляционная петля
Еще раз повторюсь, обязательно стерилизуйте инокуляционную петлю после каждой произведенной инокуляцией и сократите до минимума время, в течение которого пробирка остается открытой. После небольшой тренировки такие переносы будут получаться быстро и с превосходными результатами.
Стерильный перенос на зерно для создания посадочного мицелия
Следующим шагом в процессе культивирования будет увеличение количества мицелия путем выращивания его на зерне, получение так называемого "зернового мицелия". Грибные культуры, выращенные на зерне, легко размножаются при перетряхивании зерна и, как будет видно дальше, путем переноса из одной емкости в другую. Например, одна бутылка зернового мицелия может быть использована для инокуляции многих десятков литров плодоносящего субстрата. Зерно достаточно дешево и всегда имеется в магазинах здорового питания или в магазинах для животных.
Зерно легко колонизируется многими сапрофитами, с число которых входят такие виды, как Pleurotus (Вешенка, устричный гриб) и Agaricus (шампиньон и его сородичи).
Вот две одинаково хорошо зарекомендовавшие себя методики. В первой используются бутылки объемом 0.33 или литровые из-под пива, воды или напитка и зерно пшеницы, которое можно заменить ржаным. Во второй методике используются стеклянные банки для консервирования и зерновой корм для птиц. Несмотря на то, что в обоих случаях возможны вариации с видами используемого зерна, изначально эти методики дают немного разные результаты. Попробуйте несколько вариантов и выберите для себя наилучший.
Основное преимущество бутылок состоит в том, что их горлышки имеют меньший размер и, соответственно, шансы на заражение также меньше. Это преимущество в дальнейшем может обернуться недостатком: через узкое горлышко гораздо труднее извлечь содержимое бутылки.