Страница 60 из 107
После вентиляции в течение нескольких минут, закройте клапан (в соответствии с инструкцией к конкретной скороварке).
Кипятите бутылки под давлением 1 атм. (121 градус по Цельсию) в течение 15 минут. Не позволяйте температуре подниматься выше 121 градуса даже на самое короткое время, иначе произойдет карамелизация среды и она придет в негодность.
Через 15 минут выключите газ и дайте скороварке медленно остыть (в течение примерно 45 минут). Тем временем, снимите с пробирок колпачки, установите пробирки на штативе или в чистых консервных банках и поставьте штатив или консервные банки на чистую рабочую поверхность в месте, свободном от пыли. Когда бутылки с питательной средой остынут и их можно будет брать с помощью чистого полотенца или варежек для микроволновой печи, извлеките их из скороварки и перенесите к пробиркам. Круговыми движениями слегка перемешайте питательную среду, а затем удалите фольгу и хлопчатобумажные тампоны. Используя воронку, заполните пробирки примерно на одну треть.
Наверните свободно колпачки на пробирки, поместите банки с пробирками в скороварку (убрав из скороварки лишнюю воду, если нужно), дождитесь увеличения давления до 1 атм. (121 градус по Цельсию) и оставьте вариться на 30 минут. После этого снова дайте скороварке постепенно остыть, чтобы давление снизилось до нормального.
Извлеките пробирки и закрутите колпачки плотнее. Закрепите пробирки каким-нибудь способом в наклоненном положении, чтобы поверхность агаровой среды приобрела "скошенный" вид, предоставляя максимальную поверхность для дальнейшего роста мицелия. (Пробирки, приготовленные таким образом, часто называют "косым агаром").
По мере того, как среда охлаждается, она будет застывать в виде желе и, в конечном счете, пробирки можно будет вернуть в вертикальное положение; агаровая среда при этом останется на месте. Если пробирки не предполагается использовать сразу, их можно поместить в зип-локи и хранить в холодильнике в течение недель или месяцев. В дальнейшем, перед использованием пробирок из холодильника, необходимо убедиться в отсутствии заражения среды плесенью или бактериями.
Картофельный агар. Метод № 2
(получается около литра питательной среды)
Необходимые материалы:
• 10 унций или 284 грамм картофеля
• 3/4 унции или 21.3 грамм агара
• 1/4 унции или 8 грамм декстрозы — можно заменить столовым сахаром
Шаг 1: Смешивание ингредиентов
1. Вымойте картофель, но не срезайте кожуру. Порежьте на небольшие кусочки.
2. Сварите картофель до хорошей готовности в полулитре воды.
3. Процедите и сохраните отвар. Картофель можно выбросить или использовать в пищу.
4. Смешайте декстрозу/сахар, картофельный отвар и агар в металлической или термостойкой стеклянной чашке. Добавьте воды до литра.
Шаг 2: Растворение агара
1. Поместите агаровую смесь в скороварку. Накройте чашку алюминиевой фольгой.
2. Дождитесь, пока давление в скороварке поднимется до 1 атм. Варка в течение 20 минут приведет к полному растворению агара.
3. Оставьте скороварку для медленного остывания.
Шаг 3: Заливка агара в пробирки
1. С помощью варежек для микроволновки и мерного стакана заполните каждую пробирку примерно на треть объема. Вместо штатива для пробирок могут быть использованы консервные банке. Оставшийся агар можно сохранить в бутылке, закрытой хлопчатобумажным или синтепоновым тампоном, а стерилизовать позже, вместе с пробирками. Если пробирки достать не удалось, вместо них можно использовать небольшие бутылочки.
2. Если пробирки закрываются пластиковыми колпачками, то они должны закрываться неплотно, чтобы давление в процессе стерилизации выравнивалось. Хлопчатобумажные или синтепоновые тампоны помогают избежать этой проблемы, но при этом потребуется накрыть пробирки алюминиевой фольгой, чтобы капли конденсата с крышки остывающей скороварки не попадали на пробки.
Шаг 4: Стерилизация агара
1. Поместите пробирки/бутылки, содержащие агар, в скороварку и стерилизуйте под давлением 1 атм. в течение 25 минут. В эти 25 минут не входит время, необходимое для достижения нужного давления в скороварке.
2. Дайте скороварке медленно остыть. Быстрый сброс давления может привести к интенсивному вскипанию агара в пробирках, выплёскиванию его через тампоны и колпачки пробки и к возможному заражению.
Шаг 5: Наклонное расположение пробирок
1. Протрите 10 % раствором хлорсодержащего отбеливателя стол, на котором будут расположены в наклоненном положении пробирки. Работу следует производить в помещении без сквозняков.
2. Надев кухонные варежки, расположите горячие пробирки на столе в наклоненном положении, положив пробирки одним краем на подходящий предмет. Предварительно стоит поэкспериментировать с деревянными брусочками или стопкой журналов для того, чтобы подобрать нужный угол наклона.
3. После желатинизации агара закройте плотнее колпачки. Готовые пробирки или бутылки следует хранить в прохладном, свободном от пыли месте. Покрытие из алюминиевой фольги предотвратит возможность заражения пробирок до их использования.
Методики стерильной работы с грибной культурой
После того, как агаровые пробирки остыли, самое время заняться разведением грибной культуры. Необходимые материалы:
• Скальпель или очень острый нож с тонким лезвием
• Спиртовка или пропановая горелка с баллончиком, зажигалка или спички (Прим. ред.: Вместо спиртовки лучше использовать "факел", просто налейте немного спирта на крышку металлической банки из-под растворимого кофе и подожгите его).
• Металлические консервные банки или штативы для пробирок с косым агаром и одна банка и штатив для хранения готовых пробирок
• Держатель для скальпеля или ножа (см. ниже примеры для самостоятельного изготовления)
• Микропористый бинт (такой, как в аптечках первой помощи, продается в аптеках) или обычный бинт (более дешевый вариант)
• Распылитель с раствором из 10 % хлорсодержащего отбеливателя и 90 % воды (необязательно)
• Свежее, чистое плодовое тело гриба или грибов (для начинающих микологов очень рекомендуется использовать вешенку)
Выберите место в доме, офисе или лаборатории, свободное от пыли и возможных источников плесени или грибков. Работы производите на устойчивом столе или стойке, предварительно вымыв поверхность теплой мыльной водой и вытерев насухо (для дополнительной защиты можно также обработать поверхность аэрозолем из 10 % раствора отбеливателя и вытереть затем насухо чистой тряпкой или бумажной салфеткой.) Закройте все окна, чтобы свести к минимуму циркуляцию воздуха (в идеале, постарайтесь перенести работы по культивированию на утренние часы, пока воздух чист от пыли, поднимаемой в воздух активными домочадцами).
Разложите все материалы в готовом для работы виде и в пределах удобной досягаемости. Поместите агаровые пробирки в металлическую консервную банку (банки) или штативы. Зажгите свет или включите светильник. Тщательно простерилизуйте лезвие скальпеля в пламени и положите скальпель на подставку. Подставку можно выгнуть из проволоки (например из старой вешалки), жестяной банки или другого подручного материала. Целью изготовления такой подставки является обеспечение устойчивого положения инструмента, чтобы его лезвие, пока оно не используется, находилось возле пламени во избежание заражения.
Для начала возьмите свежий, чистый гриб. Несмотря на то, что внешняя поверхность грибного тела может содержать бактерии и споры плесени, внутренняя ткань обычно свободна от организмов, вызывающих заражение, если только гриб не перенасыщен водой.
Оторвите или отломите часть гриба (не отрезайте с помощью ножа, потому что лезвие занесет инфекцию с внешних поверхностей). Положите гриб на стол чистой поверхностью вверх (эта поверхность не должна касаться стола). Цель тут состоит в том, чтобы получить чистую, открытую поверхность, от которой может быть отделен очень небольшой кусочек грибной ткани, а сам кусочек оставался бы, насколько это возможно, нетронутым, пока не будет помещен в пробирку.