Страница 57 из 107
"Технический контроль" и отбраковку неправильно изготовленных белковых молекул осуществляют опять-таки белки. Обнаруживает дефектные молекулы белок паркин, который "навешивает" на них специальные "бирки" — что-то вроде табличек "Брак!". Эти "бирки" — цепочки молекул убиквитина, прикрепленные к "неисправным" белкам, — являются инициаторами начала работы белковых структур под названием протеосомы.
Протеосомы выполняют функции "баз разделки" (такие существуют на флоте и в авиации), где разбирают на запчасти и режут на металлолом отслужившие свой срок корабли и самолеты. Аналогично "поступают" и протеосомы. Помеченные убиквитином белковые молекулы они "разбирают на запчасти" — деструктурируют до отдельных аминокислот, которые могут быть вновь использованы для "производства" любых других белковых молекул.
Лигаза
Добавим к выбранному нами вектору рестриктазу и подходящий для ее работы солевой раствор (он прилагается к купленному ферменту) и поставим пробирку в термостат, разогретый до 37 °C. Через час все кольцевые молекулы вектора в растворе станут линейными — рестриктаза нашла свой сайт на полилинкере и разрезала в этом месте ДНК. Теперь смешаем разрезанный вектор и кДНК и добавим новый фермент — лигазу. Если рестриктаза играет в нашей работе роль ножниц, то лигаза, наоборот, является иголкой, сшивающей две молекулы ДНК. Спустя несколько часов все молекулы вектора снова станут кольцевыми, но теперь внутри полилинкера в каждой из них будет содержатся по одной молекуле кДНК. Правда, некоторые молекулы вектора "зашились" обратно сами на себя — для борьбы с этим явлением существуют специальные способы, но мы сейчас обойдемся без них, просто возьмем в следующую стадию побольше ДНК и будем надеяться на лучшее.
Ампициллин
Мы достигли кульминационной части первого этапа работы — в нашей пробирке находится смесь молекул кДНК коралла, среди которых и ген зеленого флуоресцентного белка. Осталось поместить все эти молекулы в бактерии (такая процедура называется трансформацией) и посмотреть, что получится.
Технически трансформация Е.coli производится очень легко. Достаточно смешать бактерии и вектор, добавить немного солей кальция и пропустить через смесь короткий импульс электрического тока. Некоторые бактерии при этом погибают, с другими ничего не происходит, но многие почему-то "всасывают" в себя ДНК вектора. Почему так происходит, никто не знает, тем не менее все генные инженеры пользуются этим странным свойством Е.coli.
Возьмем стерильный стеклянный шпатель и вотрем трансформированные бактерии в плоские чашки, содержащие питательную среду и антибиотик ампициллин. Используемый нами вектор содержит ген устойчивости к ампициллину, кодирующий специальный фермент, который успевает разрушить молекулы антибиотика до того, как антибиотик убьет бактерию. Таким образом, на нашей питательной среде выживут только бактерии, "проглотившие" вектор, все ^трансформированные бактерии погибнут. Поставим чашки с бактериями на ночь в теплое место, пусть подрастут.
На следующее утро внимательно рассмотрим содержимое чашек. На агаровом геле видны бляшки диаметром около полумиллиметра — это колонии бактерий. Каждая колония является потомством одной единственной трансформированной бактерии, попавшей вчера в чашку, соответственно все бактерии внутри одной колонии содержат один и тот же вектор. Берем синюю лампочку (а еще лучше — ставим чашку под флуоресцентный микроскоп) и начинаем искать.
Нам придется исследовать около сотни тысяч бактериальных колоний (не волнуйтесь, это всего несколько десятисантиметровых чашек). Почти все колонии оказались неокрашенными, но вот смотрите — одна колония ярко светится зеленым светом! Нам повезло, мы нашли бактерии, трансформированные вектором с геном зеленого флуоресцентного белка. Вполне возможно, что мы обнаружим еще несколько таких колоний, некоторые из них будут светиться не зеленым, а желтым или красным светом — значит, там экспрессируются желтый или красный флуоресцентный белок, это уже не важно. Берем деревянную зубочистку и аккуратно дотрагиваемся кончиком до светящейся колонии. Теперь кидаем зубочистку в колбу с питательной средой — нам надо много бактерий, чтобы выделить из них вектор.
…и снова центрифуга
На следующее утро питательная среда в колбе стала мутной — это размножились попавшие туда бактерии. Все они содержат нужный нам ген, осталось только выделить из них ДНК, чтобы перенести этот ген в мышь. Как выделить ДНК из бактерий, мы уже примерно представляем — методика очень похожа на выделение РНК из коралла, только содержит меньше стадий. Прокрутим среду с бактериями на центрифуге, к осадку добавим немного щелочи и соли SDS (это основной компонент мыла и стиральных порошков), чтобы разрушить клеточные стенки бактерий. Центрифугируем, избавляемся от нерастворенных остатков бактерий, из полученного чистого раствора осаждаем ДНК путем добавления спирта и ацетата натрия и растворяем ее в воде.
Мы получили раствор, содержащий огромное количество копий вектора со вставленным в них геном зеленого флуоресцентного белка из коралла. На это ушло около недели и несколько десятков тысяч долларов, потраченных на приборы и реактивы. В принципе, за пятьсот долларов мы могли бы купить уже готовый вектор, но так было бы неинтересно. Теперь надо вырезать из вектора ген флуоресцентного белка (мы уже знаем, что это делается с помощью рестриктазы) и очистить ДНК нашего гена от ДНК вектора.
В 2000 году появились сразу две научные публикации, в которых рассказывается о создании молекулярных механизмов, полученных путем встраивания специфических нуклеотидных последовательностей в однотипные клетки Escherichia coli (Е.coli — представителя кишечной флоры человека). Устройство Майкла Эловица (Michael Elowitz) и Станислауса Лейблера (Stanislaus Leibler) из Принстонского университета, состоявшее из трех взаимодействующих генов, заставляло ритмично мигать несущую его клетку Е.coli — она становилась похожа на крошечную лампочку елочной гирлянды.
В начале прошлого года шестнадцать студентов разработали четыре генетические программы, обеспечивающие синхронное мигание клеток Е.coli — подобный эффект иногда наблюдается у светлячков. Молодые исследователи не знали, как синтезировать нужные ДНК-последовательности, но это и не входило в их планы. Пятьдесят восемь деталей, необходимых для сборки, были изготовлены на заказ в компании по синтезу ДНК и пополнили каталог стандартных биологических элементов, поддерживаемый Массачусетским технологическим институтом. В его базе данных сегодня — больше ста сорока подобных элементов, и их число увеличивается с каждым месяцем (см. www.genoterra.ru/news/view/18/817).
Бромид этидия
Отделение двух (или больше) разных фрагментов ДНК друг от друга производится с помощью физического метода, который называется электрофорезом. Технология основана на том, что последний нуклеотид в молекуле ДНК несет на себе отрицательный заряд. Если поместить ДНК в электрическое поле, она будет двигаться от анода (-) к катоду (+). Если поместить ДНК в вязкий раствор, например в агарозный гель (собственно, это обычное желе, только без вкусовых добавок), более длинные молекулы ДНК будут двигаться к катоду медленнее — им труднее протискиваться через агарозу. Поскольку фрагменты ДНК одинаковой длины будут двигаться с одинаковой скоростью, мы в итоге получим гель, на котором ДНК распределена в виде полосок. Полоски, содержащие более длинные фрагменты, будут находиться ближе к аноду, короткие фрагменты протиснутся дальше к катоду. Для того чтобы полоски были видны, в гель добавляется специальное вещество, бромид этидия — он связывается с ДНК и светится под ультрафиолетом. Не забудьте надеть перчатки — бромид этидия является канцерогеном (впрочем, не слишком сильным, когда-то его использовали в качестве глистогонного средства).