Страница 128 из 149
2. Получение экспланта. В стерильную чашку Петри с каплей 0.25 % раствора трипсина или питательной среды помещают фрагмент кожи. Придерживая пинцетом, нарезают на мелкие кусочки величиной с булавочную головку и меньше стерильным лезвием безопасной бритвы, зажатой в зажим Кохера или Пеана. При помощи изогнутой препаровальной иглы кусочки извлекают из капли и помещают на покровное стекло, находящееся в пенициллиновом флаконе или пробирке Лейтона. Уложенные кусочки накрывают другим покровным стеклом, слегка прижимая препаровальной иглой. Наливают в культуральный сосуд питательную среду так, чтобы она покрыла верхнее стекло. Покровные стекла с зажатыми между ними кусочками кожи при помощи пинцета кладут на боковую стенку пенициллинового флакона. Флаконы плотно закрывают пробкой и устанавливают на подставке под углом примерно в 30°. Культуры инкубируют в термостате при 37 °C. В течение недели следят за цветом среды. Изменение цвета индикатора к желто-оранжевому свидетельствует о хорошем состоянии экспланта.
Через неделю ежедневно начинают просматривать культуру под микроскопом. Можно использовать как инвертированный, так и обычный микроскоп. В последнем случае следует осторожно повернуть флакон, при этом стекла с культурой прилипают к боковой стенке флакона и могут быть исследованы при малом увеличении. Вокруг кусочков вначале появляются единичные фибробласты, которые заметны в виде длинных веретеновидных клеток, либо появляется слой эпителия, окружающий фрагмент в виде "кружевного" ореола. При появлении зоны выроста клеток следует сменить среду. Когда клетки займут все пространство между кусочками (это видно невооруженным глазом или при помощи лупы), их пересевают.
Пересев фибробластов человека
Материалы и оборудование
Флаконы с питательной средой, трипсин, покровные стекла, пипетки, препаровальные иглы.
Пересевы производят для получения количества клеток, достаточного для цитогенетического или биохимического исследования, а также для криоконсервации. Клеточный штамм считают установившимся, если после пассирования в течение первых 5 пассажей прирост клеток спустя 3–4 суток после пересева превосходит количество посеянных минимум вдвое, что позволяет пересевать такие клетки в отношении 1:2 (из одного сосуда в два).
Ход работы
Удаляют питательную среду из культурального сосуда и наливают 2–3 мл подогретого 0.25 % раствора трипсина (или смесь версен-трипсин). Через 2 минуты удаляют трипсин, оставив его только между стеклами. Инкубируют в термостате 15–20 минут при 37 °C. Ход трипсинизации можно контролировать, просматривая культуры под микроскопом.
По окончании трипсинизации при помощи препаровальной иглы отделяют одно стекло от другого и при помощи тонко оттянутой пипетки смывают клетки небольшим количеством среды (1 мл). При этом несколько раз пропускают через пипетку суспензию клеток и кусочки. Суспензию клеток переносят в пенициллиновый флакон и добавляют среду до 2–3 мл. Оставшиеся в прежнем сосуде кусочки снова укладывают между двух покровных стекол и заливают средой. От этих вторично культивируемых эксплантов может быть получен второй "урожай" клеток.
Флакон с пересаженными растущими фибробластами просматривают ежесуточно под микроскопом. Когда образуется слившийся слой клеток, производят второй пересев (обычно через 4–7 суток).
Контроль штаммов
Ежедневный просмотр культуральных сосудов для оценки цвета среды и её прозрачности. Резкое изменение цвета и появление мути может свидетельствовать о бактериальном или грибковом заражении. Если цвет индикатора среды не изменяется после пересева или сдвигается в сторону малинового, это может быть связано с отсутствием размножения клеток, с недостаточным количеством для данного объема или гибелью. При помощи инвертированного микроскопа оценивается морфология клеток и слоя в целом.
В нормальных условиях фибробласты — веретенообразные вытянутые клетки с прозрачной цитоплазмой. Отсутствие рисунка на субстрате (фибробласты обладают ориентированным ростом), появление зернистости в цитоплазме, пустые места в слое клеток, распластанность клеток свидетельствует об их дегенерации в результате токсических или иных вредных воздействий. Небольшое количество среды после каждого пересева отливают для проверки на стерильность, которую производят путем посева на агар.
ПРАКТИКА
Разведение пивных дрожжей в домашних условиях
Е. Свидерский
Довольно часто перед домашним пивоваром встает вопрос, где взять качественные пивные дрожжи. Сейчас достаточно много фирм предлагают сухие дрожжи низового брожения, которые великолепно подходят для домашнего пивоварения. Однако их ассортимент в России очень ограничен. Как правило, дрожжи «интересных» сортов привозятся из заграничных командировок. При этом их количества весьма ограничены и без принятия соответствующих мер все расходуется за пару варок, поэтому становится актуальна проблема размножения дрожжей дома.
Самый простой способ практически не требует усилий. Достаточно после брожения собрать дрожжевой осадок в банку и хранить в холодильнике под слоем чистой воды. Однако при этом дрожжи очень быстро деградируют, в них попадают посторонние бактерии и через пару варок их смело можно выбрасывать, ничего приличного с их помощью уже сбродить не удастся. Если хочется сохранить дрожжевую культуру надолго и с минимальными потерями качества, придется основательно потрудиться.
Во-первых, очень возрастают требования к стерильности. Если маленькое попадание посторонних бактерий в ферментатор обычно не фатально, то в данном случае оно способно сильно испортить ситуацию.
Для начала готовим питательную среду. Кипятим примерно 6–8 % раствор Малтакса[85] минут 15–20 до его стерилизации. Остужаем раствор, сливаем чистую жидкость от белковых хлопьев на дне. Кипятим еще раз, прямо в банке на водяной бане (водяная баня — это обычная кастрюля, в которую налито сантиметров 5-10 воды), при этом простерилизуется как банка, так и жидкость. Охлаждаем банку в закрытом виде. Дальше зажигаем газ, ставим банку рядом с огнем (сантиметров 5-10), открываем крышку и стерильной ложкой (можно ее прокалить на том же газу) взбалтываем Малтакс, чтобы немного насытить его кислородом. Огонь нужен для того, чтобы создать восходящий поток воздуха. При этом есть гарантия, что в процессе перелива никакая пылинка или злобная бактерия не упадут в нашу банку сверху.
Засыпаем дрожжи, закрываем, но не герметично и ставим в темное место. Спустя пару дней, не дожидаясь полного окончания брожения, необходимо поставить банку в холодильник, чтобы остановить брожение. Ждем еще с день-два, дрожжи оседают на дно. Аккуратно сливаем жидкость (совсем хорошо перед этим протереть спиртом горловину банки и делать переливы у огня).
После этого промываем дрожжи. Для этого сливаем с дрожжевого осадка жидкость, наливаем чистую стерильную охлажденную воду, закрываем, взбалтываем, и оставляем на день в холодильнике. Повторяем процедуру 2–3 раза.
Теперь дрожжевой осадок нужно поставить на хранение. Вариант попроще: на лить немножко воды (разумеется, прокипяченной, стерильной и охлажденной), взболтать и разлить по стерильным баночкам, после чего хранить в холодильнике примерно при плюс 5 градусах. Более продвинутый вариант — добавить в воду процентов 10–15 глицерина и хранить в нулевой камере при температуре около нуля. В первом случае срок хранения примерно месяца 2, во втором — около 4 месяцев, потом требуется процедуру размножения дрожжей повторить. Перед употреблением дрожжи нужно разбраживать, т. к. их концентрация намного меньше, чем в случае применения сухих дрожжей.