Трещина в мироздании

В начале 1980-х, пока другие ученые были поглощены мыслями о направленном воздействии на гены в клетках человека, Джек Шостак пытался разобраться в процессе клеточного деления у дрожжей. Шостак был профессором Гарвардской медицинской школы (и затем моим научным руководителем в работе над докторской диссертацией), и его занимал фундаментальный вопрос: как вообще возможны направленное воздействие на гены и гомологичная рекомбинация? В частности, Шостак хотел понять, каким образом две цепочки ДНК из одной хромосомы могут объединяться с двумя соответствующими цепочками ДНК из второй хромосомы, обмениваться информацией, слившись на время некой промежуточной стадии, и затем разделяться вновь, заново образуя отдельные хромосомы после деления клетки.

В 1983 году, когда я все еще была студенткой Помона-колледжа в Калифорнии, Шостак на другом конце страны решил, что нашел ответ. Основываясь на результатах экспериментов по генетике дрожжей, он и его магистрантка Терри Орр-Вивер вместе с профессорами Родни Ротштайном и Фрэнком Сталем обнародовали смелую модель[33], согласно которой провоцирующим фактором – сигналом, запускающим процесс гомологичной рекомбинации, – было разрезание одной из двух хромосом, что приводило к двуцепочечному разрыву ДНК. Согласно этой модели, двуцепочечный разрыв и освободившиеся концы ДНК на месте разрыва были особенно подвержены слиянию, а располагающиеся по бокам их последовательности с гораздо большей вероятностью могли быть вовлечены в обмен генетической информацией с соответствующей хромосомой (или, в случае редактирования генома, – с соответствующей ДНК, которую предоставлял исследователь).

К тому времени как я пришла в лабораторию Шостака в 1986 году, он уже сменил центральную повестку своих исследований на изучение роли молекул РНК на начальных этапах эволюции жизни на Земле. Однако в лаборатории мы с коллегами обсуждали модель двуцепочечных разрывов, ее изящество и тот неприкрытый скепсис, с которым она была встречена в научном сообществе. Но с течением времени становилось все яснее, что эта модель согласуется с большим количеством экспериментальных данных. Механизм репарации двуцепочечных разрывов казался логичным не только в случае процесса гомологичной рекомбинации при формировании яйцеклеток и сперматозоидов, но и при рекомбинации, происходящей каждый раз, когда была повреждена ДНК. Все клетки подвержены разрушительным для ДНК воздействиям, будь то рентгеновское излучение или канцерогены, и надо отметить, что клетки весьма эффективно справляются с репарацией таких разрывов, не теряя при этом генетической информации. Согласно модели Шостака, этот процесс репарации зависел от возможности хромосом обмениваться фрагментами посредством гомологичной рекомбинации, и именно поэтому наличие двух копий хромосом является выгодной эволюционной стратегией. Любое повреждение одной из хромосом можно репарировать, просто скопировав соответствующую последовательность со второй хромосомы.

Если модель двуцепочечных разрывов верна и выводы, полученные на дрожжах, справедливы и для млекопитающих, возникает очевидная возможность улучшить эффективность редактирования генома: сделать надрез в ДНК в точности в том месте, где необходимо провести редактирование. Если предстоит заменить дефектный ген в геноме на исправленную копию, созданную в лаборатории, то сначала нужно понять, как разрезать дефектный ген, вызвав локальный двуцепочечный разрыв в ДНК, – а затем добавить исправленную копию гена. Клетка, “почувствовав” разрыв, попыталась бы восстановить повреждение, начав поиск соответствующей хромосомы для копирования, – тут-то ученые и “подсунули” бы ей синтезированный ген. По сути дела, можно было заставить клетку “подумать”, что повреждение ее ДНК произошло по естественным причинам, и предоставить ей новый фрагмент ДНК под видом второй хромосомы, которую клетка могла бы использовать для репарации поврежденного участка.

В 1994 году исследователи из лаборатории Марии Джесин в Мемориальном онкологическом центре имени Слоуна – Кеттеринга (Нью-Йорк) стали первыми, кому удалось “обмануть” таким образом клетки млекопитающих, – об этом прорыве я читала с большим интересом, находясь неподалеку, в Нью-Хейвене, куда я только что приехала после завершения работы постдоком в Боулдере. Мне было чрезвычайно интересно узнать об этой важной работе, которая была основана на предложенной моим научным руководителем модели двуцепочечных разрывов и выполнена исследовательницей, которая, как и я, была увлечена молекулами жизни.

Эксперименты по редактированию генома, проведенные Джесин, были оригинальными и новаторскими. Ее стратегия заключалась в введении в мышиные клетки ферментов, разрезающих геном и создающих двуцепочечные разрывы; одновременно с этим она добавляла в клетки фрагменты синтезированной ДНК (шаблоны для репарации), соответствующие разрезанной последовательности ДНК. Затем исследовательница проверяла, получилось ли у мышиных клеток восстановить поврежденную ДНК с помощью вставки шаблона для репарации. Проводя этот же самый эксперимент с добавлением фермента и без него, Джесин смогла проверить свою гипотезу, что искусственно созданный двуцепочечный разрыв повышал эффективность гомологичной рекомбинации.

Сложность заключалась в том, чтобы подобрать подходящий фермент, разрезающий геном только в одном определенном месте из миллиардов возможных вариантов. Чтобы решить эту проблему, Джесин остроумно позаимствовала часть молекулярного механизма из дрожжей: эндонуклеазу I-SceI[34].

Нуклеазы – это ферменты, разрезающие нуклеиновые кислоты; одни режут РНК, другие – ДНК. Эндонуклеаза делает “надрез” где-то внутри цепочек, в отличие от экзонуклеаз, которые работают исключительно с концами цепочек. Некоторые эндонуклеазы чрезвычайно губительны для клеток, поскольку они “режут” практически любой фрагмент ДНК, который встречается им на пути, вне зависимости от последовательности нуклеотидов в нем. Другие эндонуклеазы действуют очень специфично и разрезают только строго определенные последовательности; а большинство ведет себя как нечто среднее между первыми и вторыми.

Эндонуклеаза I-SceI, которую выбрала Джесин, была одной из наиболее специфических эндонуклеаз, известных к тому времени: фрагмент ДНК должен был содержать определенную последовательность из восемнадцати нуклеотидов, чтобы фермент сделал в нем разрез. Использование высокоспецифичной эндонуклеазы было критически важно: если бы Джесин выбрала слишком “неразборчивый” фермент, он бы “порезал” геном как попало, и это не только сделало бы результаты более сложными для интерпретации, но и, вероятно, повредило бы клетку. Однако, обладая специфичностью к восемнадцатибуквенной последовательности ДНК, I-SceI разрезает только один фрагмент ДНК из более чем пятидесяти миллиардов возможных комбинаций. (По иронии судьбы, в мышином геноме нет подходящей последовательности из восемнадцати “букв”, поэтому, прежде чем приступить к своему эксперименту, Джесин пришлось добавить копию этой последовательности в ДНК мышей – чтобы ферменту было что резать.)

Результаты эксперимента Джесин[35] были потрясающими. Она добилась того, что точная репарация мутировавшего гена посредством гомологичной рекомбинации прошла в целых 10 % клеток; сейчас эта эффективность может показаться не слишком высокой, однако это было в сотни раз лучше, чем у лучших из достигнутых к тому времени результатов. На тот момент это было наиболее многообещающее свидетельство того, что гомологичная рекомбинация может рано или поздно позволить ученым переписывать генетический код без риска незаконной рекомбинации или риска случайного встраивания в геном различных последовательностей при использовании ретровирусных векторов. Стоит лишь инициировать двуцепочечный разрыв в нужном месте – и фактически все остальное клетки сделают сами.

33

J. W. Szostak et al., “The Double-Strand-Break Repair Model for Recombination”, Cell 33 (1983): 25–35.

34

Sce в названии фермента указывает на организм, из которого данный белок был впервые получен. Это сокращение от Saccharomyces cerevisiae, латинского названия дрожжей.

35

P. Rouet, F. Smih, and M. Jasin, “Introduction of Double-Strand Breaks into the Genome of Mouse Cells by Expression of a Rare-Cutting Endonuclease”, Molecular and Cellular Biology 14 (1994): 8096–8106.