Страница 7 из 9
В последний экспериментальный день после интраперитониальной инъекции алкоголя (этанола; 0,5 г/кг) животных помещали на 30 мин в экспериментальную клетку, содержащую педаль и кормушку, для обучения пищедобывательному навыку нажатия лапами на педаль. Нажатие на педаль приводило к появлению порции пищи в кормушке (кубик сыра). Данное пищевое поведение не требовало использования вибрисс как условия достижения результата (в отличие от питьевого поведения, приобретенного ранее). Видеозапись поведения осуществлялась на цифровую видеокамеру, закрепленную на верхней стороне экспериментальной клетки пищедобывательного навыка. Анализ видеозаписи поведения был осуществлен с использованием программы Easy Track, которая позволяет оценивать поведение животного в «зонах интереса». В качестве таковых было выбрано четыре зоны: зона эффективной кормушки, зона эффективной педали, зона неэффективной кормушки, зона неэффективной педали.
Через 75 минут после окончания сессии обучения пищедобывательному навыку животных усыпляли ингаляционным наркозом (эфиром), мозг извлекали и замораживали в парах жидкого азота. Животные группы пассивного контроля были взяты из домашней клетки вивария непосредственно перед извлечением мозга.
Для оценки распределения с-Fos-положительных нейронов в головном мозге были проанализированы бочонковое поле соматосенсорной коры (поскольку известно, что нейроны данной области активируются при использовании грызунами вибрисс), а также ретросплениальная кора, в которой, как нам известно (см.: Горкин, Шевченко, 1995; Александров, 2011б; Александров и др., 2015; Alexandrov et al., 1990а, 1991, 2000; Gavrilov et al., 1998; Svarnik et al., 2005), большой процент нейронов у крыс специализируется относительно пищедобывательного акта инструментального поведения – нажатия на педаль. Анализ распределения Fos-положительных нейронов проводился на фронтальных криостатных 20-микронных срезах головного мозга крыс. Срезы брались с шагом в 80 микрон на уровне 3,36–4,36 от брегмы, что позволило в дальнейшем анализировать соматосенсорную и ретросплениальную кору (Paxinos, Watson, 2009). После фиксации в 4-процентном параформальдегиде и промывки срезы предынкубировались в фосфатном буфере с добавлением 2,5-процентной нормальной сыворотки для снижения неспецифического окрашивания. Выявление индукции экспрессии с-Fos проводилось иммунногистохимически, в соответствии с протоколом стрептавидин-биотин-пироксидазного иммунногистохимического набора (Vectastain Elite ABC KIT, Vector, USA). Для реакции были использованы поликлональные кроличьи антитела к c-Fos (AB-5, Oncogene Science, USA) в разведении 1: 2000 (см.: Сварник и др., 2014). После появления окраски стекла были дегидратидированы проведением через серию спиртов восходящей концентрации и ксилол, а затем заключены под покровные стекла.
Срезы оцифровывались при 10-кратном увеличении на микроскопе Olympus V-110 с помощью высокоразрешающей CCD камеры (Nikon DMX-1200) и вводились в компьютер для анализа распределения иммунопозитивных клеток в мозге. Окрашенные клетки в исследуемых областях мозга были подсчитаны на компьютере с помощью морфометрической программы Image Pro 3.0.
В описываемых здесь экспериментах с введением алкоголя было выявлено, что при формировании второго, пищедобывательного навыка введение алкоголя «блокирует» реактивацию (по белку c-Fos) нейронов систем первого, питьевого навыка. Число Fos-положительных нейронов в контралатеральном бочонковом поле при обучении второму навыку под воздействием алкоголя оказалось достоверно меньшим, чем в ситуации без алкоголя (U Манна – Уитни, z = 2,72; p = 0,006; величина эффекта (effect size) r = 0,79) (см. рисунок 3). Кроме того, животные, находящиеся под влиянием алкоголя, были менее активны, чем животные, не находящиеся под влиянием алкоголя (U Манна – Уитни, z = 2,32, p = 0,02; величина эффекта r = 0,67), что выражалось как в снижении общей длины трека и общей длительности двигательной активности, так и в снижении средней скорости передвижения. Общий паттерн распределения нейрогенетических изменений в коре головного мозга под воздействием алкоголя и без него оказался одинаковым. Но при этом в целом под воздействием алкоголя число активированных нейронов в корковых структурах головного мозга оказалось в разы меньшим, чем без этого воздействия (U Манна – Уитни, p<0,01 для обеих проанализированных структур в обоих полушариях (на рисунке 3 обозначено звездочкой); величина эффекта r = 0,83 для ретросплениальной коры контралатерального полушария относительно используемой вибриссной подушки, r = 0,81 для ретросплениальной коры ипсилатерального полушария; r = 0,79 для бочонкового поля контралатерального полушария, r = 0,83 для бочонкового поля ипсилатерального полушария), что соответствует данным литературы (напр.: Lu et al., 2014).
Таким образом, было установлено, что под воздействием алкоголя меняется число нейрогенетически активных нейронов, вовлеченных в процесс приобретения нового опыта. В частности, меньше нейронов вовлекалось в этот процесс в тех областях, нейроны которых были вовлечены в приобретение первого навыка. Можно предположить, что под воздействием алкоголя дифференциация предыдущего опыта, связанная с аккомодационной реконсолидацией, происходит в меньшей степени, чем без такого воздействия. Возможно, вовлечение нейронов в новое обучение зависит от предыдущей истории их электрической активности (Guzowski et al., 2006) и связано с повышенной возбудимостью мембраны (Silva et al., 2009): поскольку позднее формируемый опыт реактивируется с большей вероятностью, чем более ранний (Сварник, 2016), это может приводить к снижению вероятности вовлечения элементов предыдущего опыта при формировании последующего.
Рис. 3. Распределение нейрогенетических изменений (оцениваемых по белку Fos) в ретросплениальной коре (РС кора, RSA) и бочонковом поле соматосенсорной коры (БП, S1BF) головного мозга крыс при формировании нового навыка без введения алкоголя (белые столбики) и на фоне введения алкоголя (серые столбики), ипси – то же полушарие головного мозга по отношению к использованной в предыдущем опыте вибриссной подушке, кнтр – противоположное полушарие
Известно, что алкоголь может оказывать различное фармакологическое действие. Предполагается, что алкоголь действует на мембранные белки нейрона, в том числе и белки ионных каналов (Peoples et al., 1996), что приводит к подавлению его активности. Недавние исследования показывают, что эффекты алкоголя на нейронную активность варьируют в зависимости от того, в какой структуре находятся нейроны (White et al., 2000). Таким образом, нельзя говорить об общем глобальном влиянии алкоголя на генерацию потенциалов действия: в одних структурах показано увеличение активности нейронов (Huang et al., 2012), а в других, наоборот, подавление активности при введении алкоголя (Verbanck et al., 1990). В наших работах было показано, что введение алкоголя в большей степени подавляет активность нейронов, специализированных относительно вновь приобретенного опыта, причем известно, что доля таких нейронов выше в корковых областях (Alexandrov et al., 1990). В то же время амнестический эффект алкоголя главным образом связывается с подавлением активности NMDA-рецепторов и потенциированием ГАМК-опосредованного ингибирования активности нейронов (Nomura, Matsuki, 2008). Характерно, что плотность распределения NMDA-рецепторов по структурам мозга не одинакова (Petralia et al., 1994), в частности, плотность данных рецепторов выше в верхних слоях коры по сравнению с нижними (Conti et al., 1997), что может быть одним из факторов, лежащих в основе неоднородного влияния алкоголя на генерацию потенциалов действия и более выраженного подавления алкоголем активности специализированных нейронов в верхних слоях коры по сравнению с нижними (Alexandrov et al., 1990).
Экспрессия c-Fos не отражает напрямую повышенную активность нейронов, а маркирует скорее процесс рассогласования, возникающий в нейронах при нехватке у них различных метаболитов, необходимых им для выживания. Формирование функциональной системы, по-видимому, – это возможность для нейронов специализироваться в отношении данной системы, обеспечивать достижение результата на уровне целостного организма и тем самым устранять рассогласование, получая необходимые метаболиты от других клеток организма. Показано, что само по себе введение алкоголя незначительно изменяет число Fos-положительных клеток (Ryabinin et al., 1995; Segovia et al., 2013), однако в стрессовой ситуации число Fos-положительных нейронов снижается по сравнению с «безалкогольным» контролем. Таким образом, снижение числа Fos-положительных нейронов при обучении под воздействием алкоголя может означать снижение числа нейронов, находящихся в состоянии рассогласования и готовых вовлекаться в процессы системогенеза. Образно говоря, алкоголь, подавляя активность NMDA-рецепторов у нейронов, заставляет нейроны временно «забыть» о нужных им метаболитах. Интересно, что нарушение функции NMDA-рецепторов связывают с нарушением процессов рассогласования, оцениваемых, например, по величине негативности рассогласования (Chitty et al., 2015).