Страница 42 из 64
Изучение его механизма – одна из центральных задач молекулярной генетики. Особый интерес представляет изучение механизма гомологической рекомбинации. Это определяется перспективами развития молекулярной медицины. Одной из важнейших стратегических задач, поставленных перед программой «Геном человека», является обнаружение изменений первичной структуры ДНК, которые приводят к нарушению функции генов и, как следствие этого, к развитию наследственных заболеваний человека. Идеальным методом лечения их является генотерапия, основанная на замене поврежденного («больного») гена здоровым. Такая замена может быть осуществлена только с помощью гомологической рекомбинации, механизмы которой у бактерий и эукариот, очевидно, во многом сходны. У бактерий выявлены два способа такой рекомбинации, осуществляемых двумя типами рекомбиназ: АТФ-зависимым белком RecA и АТФ-независимой ренатуразой. Соответственно, и у эукариот обнаружены АТФ-зависимые и АТФ-независимые ДНК-трансферазы, среди которых найдены белки, функционально сходные с RecA-белком бактерий.
Решающая роль в гомологической рекомбинации у бактерии, как указано выше, принадлежит гену recA. Его продукт – белок RecA c м. м. 38 кД – выполняет ряд уникальных функций: 1) прочно связывается с одиночными нитями ДНК; 2) способствует высвобождению разорванной нити из двойной спирали ДНК; 3) одновременно может присоединяться и к двойной спирали ДНК, и к одиночной нити и удерживать их вместе; 4) обладает свойством ДНК-зависимой АТФазы. Благодаря этому свойству обеспечивается серия конформационных изменений, которые обусловливают превращение трехнитевого комплекса с неспаренными основаниями в трехнитевый комплекс со спаренными основаниями. С помощью этой реакции происходит прямое комплементарное взаимодействие между одиночной нитью ДНК и двойной спиралью – главное событие в процессе рекомбинации. Энергия гидролиза АТФ RecA-белком используется последним для продвижения одиночной нити вдоль двойной спирали ДНК с целью нахождения того ее участка, который имеет гомологичную последовательность нуклеотидов, необходимую для замыкания водородных связей, т. е. для спаривания.
Для объяснения механизма гомологической рекомбинации предложены разные модели. В соответствии с наиболее популярной моделью, рекомбинация инициируется с помощью однонитевого разрыва в одной из двух гомологичных молекул ДНК, вызываемого эндонуклеазой, которая кодируется генами recB и recC. Образующийся при этом конец (3'– или 5'-конец) однонитевой ДНК (онДНК) атакует двойную спираль другой молекулы ДНК, отыскивая в ней гомологичный участок, и образует временную трехнитевую структуру (рис. 48, 1). В результате спаривания атакующей молекулы онДНК с комплементарной нитью другой молекулы ДНК происходит выталкивание ее освобождающейся нити (рис. 48, 2), которая в свою очередь спаривается с комплементарной нитью другой молекулы ДНК. Во время этих событий часто наблюдается удаление некоторого количества нуклеотидов, репарация образующейся бреши и лигирование ДНК, но в конечном счете образуется (рис. 48, 3) предсказанная Р. Холидеем полухиазма (греч. chiasmos – расположение в виде греческой буквы Х – хи). Парными стрелками указаны места «разрешения» полухиазмы (см. рис. 48, 3). Разрешение в одном варианте (полые стрелки) приведет к обмену фрагментами онДНК между спаривающимися молекулами ДНК, в другом (черные стрелки) – к полному кроссинговеру на уровне двунитевых ДНК.
В случае обмена с перекрещиванием нитей обе гомологичные спирали ДНК после начального этапа спаривания удерживаются вместе благодаря перекрестному обмену нитями из имеющихся четырех – по одной нити от каждой спирали. Структура, образующаяся при этом, обладает двумя важными свойствами:
1. Точка обмена между двумя гомологичными спиралями, т. е. место, где скрещиваются две их нити, может быстро мигрировать по спирали. Этот процесс получил название миграции ветвей. Миграция может значительно увеличивать области спаривания между двумя взаимодействующими нитями, изначально принадлежавшими разным молекулам ДНК.
2. Эта структура, благодаря вращению составляющих ее элементов относительно друг друга, может находиться в различных изомерных формах. Изомеризация изменяет положение двух пар нитей: две ранее перекрещивающиеся нити становятся неперекрещивающимися, и наоборот. Для прекращения процесса спаривания в каждой из двух нитей должен произойти разрыв. Если он произойдет до изомеризации, то у каждой спирали будет заменена только одна из нитей и только на коротком отрезке. Если же разрыв произойдет после изомеризации, наступит полный кроссинговер.
Рис. 48. Образование полухиазмы Холидея при асимметричном характере инициирования рекомбинации (по В. А. Ланцову):
1 – однонитевый разрыв в одной из двух гомологичных молекул ДНК; 2 – выталкивание высвобождающейся при спаривании нити ДНК и спаривание последней с комплементарной нитью другой молекулы ДНК; 3 – образование полухиазмы
Фермент ренатураза (33 кД) кодируется у E. coli геном recE. Он относится к классу «гомологических ДНК-синаптаз», которые, в отличие от RecA-белка, не обладают ДНК-трансферазной активностью и не зависят от АТФ. Эти белки участвуют в реакциях гомологической рекомбинации, индуцированных двунитевыми разрывами ДНК.
Ген recA участвует не только в процессе рекомбинации, его продукт необходим для пострепликативной репарации, индукции профага, клеточного деления и ряда других жизненно важных для бактерий функций. Рецессивные мутации в этом гене неизбежно отражаются на всех этих функциях, поэтому они получили название SOS-функций, а их совокупность объединена в единую SOS-систему (англ. SOS – сигнал бедствия: save our souls – спасите наши души или save our ship – спасите наш корабль).
Выражение любой SOS-функции зависит от активности продукта recA-гена. SOSсистема срабатывает после любых воздействий на ДНК агентами, которые повреждают ее структуру, или нарушают нормальный процесс ее репликации, или нарушают другие функции. Поэтому recA-гену принадлежит ведущая роль в обеспечении самозащиты генетической системы бактериальной клетки.
Глава 13
Молекулярные механизмы изменчивости бактерий. Организация геномов
Бактерии в силу относительной простоты их организации и короткого срока жизни подвергаются изменчивости быстрее, чем многие другие организмы. В основе их изменчивости лежат мутации и генетические рекомбинации, особенно протекающие с участием транспонируемых элементов.
Мутации – изменения в генотипе, которые стабильно наследуются. Мутации могут быть спонтанными или индуцированными. Спонтанные мутации возникают без каких-либо специальных воздействий, они происходят в результате ошибок при репликации и репарации. Средняя частота спонтанных мутаций составляет около 1 ⋅ 10-6 (одна мутантная клетка на 1 млн клеток).
Индуцированные мутации происходят с гораздо большей частотой, они возникают в результате воздействия различных мутагенов. К ним относятся физические и химические факторы, повреждающие ДНК (ионизирующая радиация, УФ-облучение, различные аналоги оснований ДНК, алкилирующие соединения, акридины, антибиотики и т. п.). Молекулярные механизмы спонтанных и индуцированных мутаций одинаковы. Точечные мутации могут быть обусловлены заменой оснований, выпадением (делецией) основания или появлением дополнительного основания (вставки). Различают простую замену оснований, или транзицию, при которой пурин заменяется на пурин, а пиримидин – на пиримидин, и сложную, или трансверсию, при которой происходит замена пурина на пиримидин или наоборот. Точечные мутации могут иметь три последствия: замена одного кодона на другой, а стало быть, одной аминокислоты на другую;
сдвиг рамки считывания, что приведет к изменению целой серии последовательностей аминокислотных остатков; возникновение «бессмысленного» кодона (УАГ, УГА, УАА), что приведет к прекращению трансляции в данной точке. В результате таких точечных мутаций синтез белка может быть полностью заблокирован за счет «бессмысленного» кодона, либо будет синтезироваться измененный (неактивный) белок, что приведет либо к утрате какого-то фенотипического признака у мутанта, либо, реже, к появлению у него нового признака. Получение индуцированных мутаций (мутантов) – один из основных способов изучения генетики микроорганизмов.