Страница 32 из 64
где E0 – начальная концентрация фермента; S – концентрация субстрата.
При увеличении концентрации [S], когда [S] > Km, скорость ферментативной реакции (V) будет стремиться к некоторой постоянной величине Vмакс– максимальной скорости реакции:
Поэтому зависимость между скоростью ферментативной реакции и концентрацией субстрата можно выразить следующим уравнением Михаэлиса – Ментен:
Из уравнения следует, что при малых величинах концентрации субстрата скорость реакции будет находиться в линейной зависимости от [S], а при очень высокой концентрации субстрата скорость реакции (V) будет стремиться к максимальной (Vмакс) и мало зависит от дальнейшего увеличения концентрации [S]. В свою очередь, при условии, когда [S] > (E), скорость реакции будет пропорциональна концентрации фермента. Основными кинетическими константами уравнения Михаэлиса являются максимальная скорость реакции (Vмакс) и константа Михаэлиса (Km). Величина последней определяется соотношением трех констант скорости. В случае, когда K+2 < K– 1, Km ≈ K– 1/K+1 = Ks.
Константа Ks получила название константы субстрата и служит мерой сродства фермента к субстрату. Поскольку скорость реакции, катализируемой ферментом, зависит от относительного сродства фермента к субстрату, константа (Ks) является важной характеристикой фермента. Поэтому уравнение Михаэлиса – Ментен может быть выражено следующим образом:
где Vмакс – предел, к которому стремится скорость реакции с повышением концентрации субстрата; Ks – константа, численно равная концентрации субстрата при V=Ммакс/2.
Колебание температурного режима оказывает на ферментативные реакции влияние таким же образом, как и на другие химические реакции. Отношение констант реакций при более высокой (Т2) и более низкой (Т1) температурах получило название температурного коэффициента: Q = K2/K1. Значение его обычно дается для интервала в 10 °C (Q10). Величину Q10 легко вычислить для любого температурного интервала ΔT по формуле:
Скорость ферментативных реакций зависит также от концентрации водородных ионов. Величина оптимальной рН и ее границы варьируют в зависимости от типа и свойств ферментов. Даже изоферменты, имеющие одинаковую субстратную специфичность, могут различаться по оптимуму рН.
Отличаясь высокой специфичностью действия, ферменты, вместе с тем, обладают многими общими свойствами, вытекающими из их белковой природы. Благодаря последним создаются условия, которые позволяют использовать опять-таки универсальные механизмы для контроля активности ферментов.
В частности, существует специфический механизм саморегуляции скоростей отдельных биохимических реакций, вытекающий из аллостерической природы белков-ферментов: конечный продукт реакции (в случае накопления некоторого избытка его), взаимодействуя с молекулой фермента, так изменяет ее конформацию, что она временно утрачивает свою активность. Этот принцип саморегуляции, получивший название регуляции по типу отрицательной обратной связи, или торможения конечным продуктом, носит универсальный характер. С его помощью создаются идеальные условия для саморегуляции, так как он не требует никакой дополнительной затраты энергии и вещества. Запуск реакций, ведущих к превращению субстрата, осуществляется самим субстратом, а их остановка – конечным продуктом. Как только содержание конечного продукта достигает определенного уровня, дальнейший синтез его прекращается. Конечный продукт выступает в роли регулятора собственного синтеза. Так осуществляется саморегуляция многих биохимических процессов и, как следствие, координация их, так как многие из них взаимозависимы по участвующим в реакциях различным продуктам. Помимо этого уровня саморегуляции, определяющего кинетику единичных ферментативных реакций, а также общую скорость и координацию большинства биохимических процессов, существует высшая форма клеточной саморегуляции, осуществляемая на генетическом уровне. В соответствии с химическими сигналами, поступающими как из внешней среды, так и эндогенным путем, клетка автоматически запускает (индуцирует) или подавляет (репрессирует) синтез соответствующих ферментов. Нетрудно видеть, что, хотя эффекты индукции и репрессии противоположны по своим проявлениям, они представляют собой две стороны одного и того же процесса, а именно – регуляции образования ферментов. Благодаря механизмам индукции и репрессии, осуществляемым с помощью соответствующих генов (регуляторов, операторов, промоторов, аттенуаторов и т. п.) и белков (репрессоров, активаторов, апорепрессоров и т. п.), клетка, в соответствии с химическими сигналами, осуществляет автоматический контроль биосинтеза необходимых ей в данное время ферментов.
Одним из проявлений регуляции синтеза ферментов на уровне генома служит так называемая постоянная или временная катаболитная репрессия. Суть ее состоит в том, что некоторые источники углерода, принимающие участие в энергетическом обмене, например глюкоза, способны подавлять биосинтез определенных ферментов. Существует предположение, что синтез биосинтетических ферментов контролируется по механизму отрицательной обратной связи – репрессией конечным продуктом, а биосинтез ферментов, участвующих в катаболизме, контролируется механизмом индукции и катаболитной репрессии.
Бактерии, как и все живые организмы, не могут существовать в природе, не получая информации из внешней среды и от себе подобных. Обмен информацией (коммуникацию) они осуществляют разными способами, например путем непосредственого контакта при конъюгации (с помощью донорных ворсинок), при формировании колоний и при других процессах. Особое значение имеет способность бактерий вступать в контакт с клетками организма человека и животных. Распознавание клеток и присоединение к ним – важнейший начальный этап реализации бактериями патогенных свойств. Другой важной формой межклеточной коммуникации служат УФ (митогенетическое излучение), электромагнитные волны светового и инфракрасного диапазонов. Дистантное взаимодействие существенно важно в регуляции переходных процессов или в стрессовых ситуациях, когда клетке надо «решить», как вести себя в необычных условиях. Важную информацию бактерии получают через посредство физико-химических факторов внешней среды (температура, pH среды и т. п.), а также специальных химических сигналов. Установлено, что бактерии синтезируют и выделяют во внешнюю среду много биологически активных соединений, которые координируют их коллективное поведение, физиологическое состояние и т. п.
У бактерий обнаружены различные системы, способные воспринимать из внешней среды физические и химические сигналы. У многих патогенных бактерий (E. coli, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и др.) обнаружены термоиндуцибельные системы, контролирующие синтез факторов патогенности. Например, у E. coli при температуре 18 – 20 °C практически не происходит синтеза факторов адгезии (пилей). Повышение температуры до 37 °C индуцирует их образование. Такой же температурозависимый контроль синтеза факторов патогенности обнаружен у возбудителей чумы (Y. pestis), дизентерии (Shigella flexneri) и других заболеваний. Целесообразность действия этих систем очевидна: факторы патогенности необходимы бактериям для обеспечения их существования в организме человека или животных, т. е. при температуре 37 °C. В иных условиях эти системы бактериям не нужны. Другим примером того, как бактерии реагируют на физические сигналы, является феномен «теплового шока», описанный еще в 1952 г. Ф. Ритоссой. Он лучше всего изучен у E. coli. Суть его заключается в том, что нагревание среды до 42 °C активизирует работу ряда генов, вследствие чего в 5 – 20 раз увеличивается синтез почти 20 белков, играющих ключевую роль в жизни клеток. Главную роль в системе теплового шока играет ген (позитивный регулятор) htpR (англ. – heat temperature protein regulator), картированный на 76-й минуте хромосомной карты E. coli. Он является представителем особой группы генов, продукты которых необходимы для роста только при температуре выше 35 °C. Продукт гена htpR – σ-белок, который играет роль σ-субъединицы РНК-полимеразы. Последняя и определяет выбор промоторов тех генов, которые входят в систему теплового шока.