Голодный ген

Здесь, в лондонской больнице Святой Марии, за несколько лет до того впервые в истории приступили к освоению этого новейшего метода. «Увлекательное было время! Перспектива позиционного клонирования явственно просматривалась почти повсеместно, его возможные результаты в экспериментах с мышами-мутантами волновали умы», — вспоминает Браун, ныне глава отделов генетики млекопитающих в Медицинском исследовательском центре и Центре генома мышей в Харуэлле, Великобритания.

Микропрепарирование, требующее чрезвычайно точного рассечения хромосом, необыкновенно тонкий и сложный процесс. Бахари подошел к делу основательно. Он собственноручно изготовил лабораторную посуду, набор безупречных игл и пипеток. Клетки мышей Натан выращивал на био-культуре, потом добавлял солевой раствор, чтобы они набухли. Набухший материал выпускался из пипетки на предметное стекло микроскопа с высоты 80-180 см. Упав, клетки от удара лопались и высвобождали хромосомы. Затем предметное стекло надо было перевернуть и поместить под окуляр: теперь при взгляде через микроскоп хорошо различались взвешенные в капельке жидкости хромосомы. Нетрадиционное — и, прямо скажем, ненадежное — положение предметного стекла давало Бахари возможность добраться до них крошечным скальпелем.

Ежедневно проделывая виртуозные манипуляции, Натан четыре месяца провел в лаборатории Брауна, сыром и мрачноватом помещении, находившемся прямо над Паддингтонской линией метрополитена. «Каждый раз, когда слышался грохот поезда, приходилось хватать все, что может упасть, — иначе оно и впрямь упало бы и было бы утеряно», — вспоминает Бахари. Нередко за считанные минуты насмарку шли усилия нескольких дней. Не имея достаточно средств, чтобы снять комнату в отеле, Натан спал на раскладушке в лекционном зале, а душ принимал в больничном бассейне. Постоянно царивший в лаборатории сумрак угнетал, но не лишал энтузиазма: Бахари двигался по пути, который доступен немногим, и понимал это.

«Натан стал настоящим мастером микропрепаривания, это было сродни искусству, — говорит Лейбл. — И надо отдать ему должное: он победил».

Через несколько месяцев после возвращения в Университет Рокфеллера Бахари применил освоенную технику для создания молекулярных клонов, которые были нанесены на генетические карты гибридов, полученных при скрещивании ob- и db-мышей. У этой помеси расстояние между соседними ДНК оказалось еще меньше, чем у родителей. В серии статей, опубликованных в начале 1990-х гг., группа Лейбла-Фридмана изложила предварительные результаты идентификации ob-гена.

Охватившее участников каждодневной изнурительной работы воодушевление омрачалось усугубляющейся нервозностью, и по мере того как росла вероятность успешного клонирования ob-гена, напряженность в лаборатории перерождалась во взаимную враждебность. Всегда далекий от мягкости и деликатности Фридман то и дело устраивал разносы коллегам, порой несправедливые. Первым проект покинул Стримсон, за ним — Дон Сейгел, аспирант, пришедший в группу позже других, следом — один из лаборантов. «Усилиями Джеффа у нас царил не сегодняшний день молекулярной биологии, а настоящий „Апокалипсис сегодня“», — до сих пор не может успокоиться Сейгел, ныне преподающий в Медицинском колледже Альберта Эйнштейна. Любопытно заметить, что любимое прозаическое произведение Фридмана — роман «Сердце тьмы», [24]легший в основу упомянутого мрачного кинофильма Фрэнсиса Копполы.

Фридману казалось, будто Лейбл и научный руководитель последнего, Джулс Хирш, пытаются играть главенствующую роль, отодвигая его, Джеффа, на второй план. Подозрительность росла, и в конце концов Фридман заявил, что Лейбл фактически отстраняет его от проекта, не допуская в лабораторию, где клонируется ob-ген. «Действительно, я имел определенный вес в научных кругах, которые занимаются исследованиями в области ожирения; и именно поэтому мы смогли получить субсидию от Ассоциации национальных институтов здоровья. Но обвинять меня в попытке выдвинуться на первое место и сделать себе рекламу за счет других участников работы было куда как несправедливо», — делится воспоминаниями Лейбл. Как старший, он чувствовал себя особенно ответственным за судьбу проекта и в начале 1993 г. решил положить конец конфликту, отказавшись от повседневного участия в проекте, но сохранив тесные контакты с лабораторией, которая по-прежнему нуждалась в его советах.

К моменту ухода Лейбла группа проработала уже шесть лет и сузила пространство поисков ob-гена до расстояния между двумя маркерами на хромосоме, отсеяв сотни тысяч других возможных предположений. Цель приближалась, но все еще оставалась неуловимой. Примерно за семь месяцев до описываемых событий, в мае 1992 г., Фридман пригласил на работу только что получившую степень доктора философии И-ин Чзан из Медицинской школы Нью-Йоркского университета. Она приехала в Университет Рокфеллера с двухмесячным первенцем, но была готова немедленно включиться в дело.

«Кое-кто считал, что я сошла с ума, собравшись применить позиционное клонирование для обнаружения гена, — говорит И-ин. — Подобные технологии обычно приводили к полному фиаско. Однако сама идея была вполне здравой, и я считала, что у нас есть неплохие шансы».

Для клонирования потенциальной ob-области в наиболее доступном для манипуляций участке ДНК Чзан применяла ту же технику, что и Дон Сейгел — дрожжевую искусственную хромосому (ДИХ). Ее коллега Рикардо Проэнца предложил еще один путь, названный им «отделением экзона». Экзоны — это участки гена, в которых закодирована информация о специфическом белке. Отделяя их от интронов, таких сведений не несущих, Проэнца сократил количество генов-кандидатов на obпримерно до двухсот. Затем Чзан и Фридман сузили область поиска до четырех, лежавших в пределах той зоны ДНК, где, по их ожиданиям, должен был бы располагаться ob-ген.

«Мы уже не сомневались, что он там, и проверили в этой области буквально каждый экспрессированный ген», — говорит Чзан. Экспрессия гена подтверждается наличием информационной РНК (и-РНК), молекулы, имеющей близкое отношение к ДНК: и-РНК транскрибирует и транспортирует копию ДНК, снятую с ее интронов. Слепок этот становится трафаретом для производства белка. В случае с obнормальный белок длиннее видоизмененного, который преждевременно прекращает свое действие и порождает в результате ob-фенотип, иначе говоря, ob-телосложение.

Исследовав великое множество экспрессированных генов, Чзан обнаружила один, ДНК которого несла в себе преждевременный стоп-сигнал, а это указывало на мутацию. Особенно воодушевляло то, что мутированный ген был найден в жировой клетке! «Мы тщательно изучили его и выделили секреторный белок, информация о котором была закодирована в гене. Всего лишь небольшая молекула, функционирующая как гормон», — гордо рассказывает И-инин.

Небольшая молекула имела все признаки столь трудноуловимого колемановского фактора насыщения: белок, продуцируемый жировой тканью, информация о котором закодирована в гене, подвергшемся мутации у ob-мышей. Но до тех пор пока гипотеза не прошла проверку в опытах с другими животными, нельзя было с уверенностью утверждать, что это именно ob-ген. Некоторое время спустя удалось установить фактическое существование двух форм данной мутации: одна из них, ob2j,не продуцировала фактор насыщения; другая, ob,производила искаженную, не способную к правильной работе его версию. Обе формы наличествовали в организме ob-мышей. Теперь следовало установить, присутствует ли соответствующая и-РНК у каждого из двух типов мышей-мутантов — то есть понять, произошла ли на самом деле у мутантных грызунов экспрессия ob-гена.

«В пятницу, 6 мая, я спланировала эксперимент на гене нормальной мыши, чтобы сравнить его с геном мутантной, — говорит Чзан, — и на следующий день, в субботу, пришла в лабораторию со своей дочерью Ирэн…»

Выяснилось, что грызуны с мутацией ob2jне продуцировали никакой и-РНК вообще, тогда как мыши с мутацией obпроизводили ее. «Тогда я на 90 % уверилась: у нас в руках тот самый долгожданный ген. Побежала к Фридману и сообщила ему об этом. „Ирэн принесла нам удачу!“ — сказал Джефф».