Страница 19 из 80
Кроме того, древние молекулы ДНК с гораздо большей вероятностью будут состоять из коротких цепочек парных нуклеотидов, нежели из очень длинных. Дело в том, что более длинные цепочки оснований, как правило, относятся к современной ДНК и, следовательно, должны восприниматься как загрязнители, тогда как более короткие последовательности стали такими естественным путем из-за возраста и распада. Ученые знают это и, прежде чем приступить к анализу, стараются устранить длинные загрязняющие цепочки ДНК.
Для удаления загрязняющих веществ и повышения концентрации исходной (эндогенной) ДНК используются и другие химические методы, в том числе с применением химических очищающих средств, такие как отбеливание костей перед экстракцией ДНК{102}. Благодаря этому и другим достижениям науки мы, примерно с 2003 г., можем извлекать из человеческих костей бесспорно древние последовательности ДНК. (Здесь же я должен сообщить, что те из моих коллег, кто ранее был настроен скептически, очень рады тому, что оказались неправы.)
Другим крупным успехом древней геномики стала разработка мощных инструментов секвенирования, которые позволяют надежно секвенировать генетический код чуть ли не на промышленной основе.
В 1990-х гг. ученые преимущественно использовали метод ПЦР – полимеразной цепной реакции. Он не потерял своей значимости и сегодня; так, ПЦР широко применялась для выявления вирусной РНК в ходе исследований, связанных с началом пандемии Covid-19 в 2020 г. Этот метод основан на копировании маленьких фрагментов ДНК с использованием фермента полимеразы и их амплификации – многократного точного воспроизведения, что облегчает их исследование. Метод ПЦР оказался поистине революционным, и его автор Кэри Муллис заслуженно получил в 1993 г. Нобелевскую премию по химии{103}. Метод дает нам возможность добывать путем амплификации огромное количество пригодной для исследования ДНК. Исходный фрагмент ДНК используется полимеразой как шаблон для синтеза все новых и новых копий. Копия остроумно строится из новых нуклеотидов (оснований), которые связаны друг с другом полимеразой, начиная с так называемых праймеров – отдельных коротких отрезков ДНК (около 20 оснований), которые присоединяются к концу одной из частей фрагмента древней ДНК. Полимераза играет примерно ту же роль, что и застежка-молния, – собирает созданные, так сказать, в пробирке одиночные свободные основания-дезоксинуклеотиды и химически привязывает их к фрагментам ДНК одно за другим, в должном порядке, многократно увеличивая количество исходной ДНК.
На этом рассказ об амплификации можно завершить. Теперь о другом: как не только извлечь хорошо знакомую нам последовательность нуклеотидов – А, Т, Ц, Г (аденин-тимин и цитозин-гуанин), уникальный код ДНК, который формирует двойную спираль, также известную как древо жизни, – но и узнать, что же она означает? Чтобы разобраться в этом, необходимо сперва понять, что такое секвенирование, а для этого нужно вернуться в 1977 г., к разработке первой технологии геномного секвенирования нобелевским лауреатом Фредериком Сэнгером[24].
Точно выстроить буквенную последовательность ДНК удается благодаря весьма находчивому методу прекращения ПЦР на том самом основании, которое нужно прочитать. Для приостановки реакции добавляются дезоксинуклеотиды другого типа, не способные образовать химическую связь со следующим основанием в последовательности, – так называемые дидезоксинуклеотиды, или ддНТФ.
Рис. 12. Схема полимеразной цепной реакции
Фрагменты амплифицированной ДНК поровну распределяются по четырем колбам, в каждой из которых содержатся дезоксинуклеотиды, включающие в себя одно из оснований: аденин, тимин, гуанин или цитозин. Затем в каждую колбу добавляется определенный ддНТФ, или нуклеотид-терминатор. Итак, в первой колбе содержится только ддНТФ, помеченный аденином, во второй – цитозином и т. д. Таким образом, в первой колбе репликация ДНК продолжится до тех пор, пока реакция не остановится в точке, где к последовательности этого фрагмента ДНК добавляется меченный конкретным основанием ддНТФ. Вы получите четыре колбы, содержащие фрагменты ДНК переменной длины, которые оканчиваются на определенном основании: аденине, тимине, гуанине или цитозине.
Теперь, чтобы выяснить, какую позицию занимают эти основания в общей последовательности ДНК, необходимо количественно определить размеры каждого фрагмента, для чего служит следующая часть сэнгеровского процесса – электрофорез. Это слово всего-навсего означает движение различных частиц под действием постоянного электрического тока в жидкости – в нашем случае, в полиакриламидном геле. Содержимое каждой из четырех колб выливают в четыре отделения с гелем и включают ток. В каждом из отделений фрагменты ДНК перемещаются от отрицательного полюса к положительному. Чем меньше и легче фрагменты, тем дальше они продвигаются, образуя при остановке видимые полосы. В первой емкости будут находиться фрагменты, движение которых прервалось на А, во второй – на Ц, в третьей – на Г и в четвертой – на Т. После завершения опыта последовательность оснований можно прочитать снизу вверх в порядке увеличения массы фрагментов, а затем расположить в правильной очередности согласно известной парности нуклеотидов. Таким образом мы получаем последовательность ДНК – АГТТЦАГЦАТАГА и т. д. Этот метод был использован для создания человеческого генома в амбициозном проекте «Геном человека», который продлился 10 лет и обошелся его спонсорам в 3 млрд долларов.
Рис. 13. Схема секвенирования по Сэнгеру
ПЦР – безусловно, гениальное изобретение – все же имеет определенные недостатки, в частности касающиеся древней ДНК. Загрязняющая ДНК подвергается амплификации с тем же успехом, что и древняя; так удобрения, которые вы вносите в почву своего сада, способствуют росту не только роз, но и сорняков. Именно это на заре применения метода было главным затруднением при анализе фрагментов ДНК, извлеченных из костей и зубов.
Однако технология секвенирования непрерывно совершенствовалась, что сильно изменило положение вещей в области изучения древней ДНК. В авангарде этой революции шла американская биотехнологическая компания 454 Life Sciences. Говорят, что ее руководитель Джонатан Ротберг пришел к мысли об усовершенствовании технологии секвенирования ДНК, когда у одного из его детей начались серьезные проблемы с дыханием. Ротберг был удручен тем, что врачам никак не удается установить природу заболевания – наследственное оно или нет. Предположительно, ответ мог бы дать полный геном. Листая в больнице журнал, Ротберг заметил на его обложке фотографию нового микропроцессора Intel Pentium и подумал, что ускорение секвенирования путем параллельной работы с многочисленными фрагментами ДНК и управление процессом посредством мощной компьютерной системы позволят улучшить генетический анализ. Как итог, он основал компанию 454 Life Sciences, целью которой было повышение скорости секвенирования. Позднее компании предстояло стать ведущим партнером проекта «Геном неандертальца», заключавшегося в секвенировании ядерного генома неандертальского человека{104}. Это исследование и другие оригинальные научные работы принесли Ротбергу большие деньги. Как известно, часть этих денег он потратил на воссоздание в своем имении на Лонг-Айленде копии Стоунхенджа. Для этого сооружения, получившего название «Круг жизни», потребовалось 700 тонн гранита, доставленного из Норвегии.
Новейшие подходы к секвенированию, привнесенные 454 Life Sciences и другими компаниями, ускорили процесс едва ли не в 100 раз. В нем появилось несколько очень важных отличий от метода Сэнгера. Первое – более продвинутая химия процесса. К обоим концам коротких фрагментов ДНК, взятых из образца, «пришиваются» так называемые адаптеры, позволяющие секвенатору распознавать начало и конец каждого фрагмента. Секвенирование осуществляется на маленькой пластинке вроде предметного стекла для микроскопа, испещренной сотнями крошечных лунок, в которых находятся полимерные капсулы. Эти капсулы содержат нуклеотидные последовательности, дополняющие адаптеры, благодаря чему они прилипают к адаптерам на конце каждого фрагмента ДНК и удерживают их на месте. После этого в волнообразном порядке добавляются соединения, содержащие нуклеотидные основания – сначала А, затем Ц, затем Г, затем Т, и, как и при секвенировании по Сэнгеру, основания одно за другим включаются в последовательность ДНК при участии полимеразы. Основное отличие заключается в том, что этап электрофореза здесь заменен на метод пиросеквенирования, который позволяет выявлять основания гораздо эффективнее. После успешного добавления нуклеотида высвобождается пирофосфат, который затем проходит химическое превращение с выделением квантов света. Сверхчувствительная камера регистрирует все вспышки на пластине и, измеряя интенсивность вспышки, определяет, какое именно основание присоединилось к последовательности. Благодаря использованию этого метода процесс секвенирования ускоряется и делается непрерывным{105}.