Страница 54 из 107
Рис. 3.1. Структурная схема экспериментальной установки.
1 — стеклянный стакан; 2 — фторопластовая крышка; 3 — активатор; 4 — управляющая мини-ЭВМ; 5 — фото-резистор; 6 — электронная схема предобработки сигнала; 7 — АЦП; 8 — осветитель; 9, 10 — перистальтические насосы; 11 — смеситель; 12 — блок электронных ключей; 13 — буферная ёмкость.
Изобретателю турбидостата, Брайсону, было куда трудней добиться желаемого. Тем не менее достигнутые результаты не впечатляют. Выводы же скорее пессимистичны. И внимательное прочтение диссертации позволило понять почему. Турбидостат в принципе, даже теоретически не годится для автоселекции штаммов, для осуществления эволюции на лабораторном столе. Во-первых, если для нейтрализации действия какого-нибудь ингибитора клетке нужно усиленно производить хоть какое-нибудь соединение, то синтез этого соединения потребует дополнительного расхода биохимической энергии (АТФ). В ущерб других процессов. И как результат скорость роста клеток будет падать. Она может возрасти только если мутации позволят использовать дополнительный источник энергии, присутствующий в среде. А это не всегда возможно. По-видимому не просто так в экспериментах использовались, для питательных сред, соли лимонной кислоты. Ингибирование закислением тоже осуществлялось с помощью лимонной кислоты. Лимонная кислота является участником цикла Кребса, поставляющего энергию клеткам. Но это мелочь. О более серьезной вещи прямо говорится в тексте диссертации: Таким образом, преследуя цель автоселекции штамма, следует производить турбидостатное культивирование в следующих условиях:
1. При больших скоростях роста (для увеличения вероятности появления, мутанта);
2. При малых скоростях скоростях роста, достигнутых действием ингибитора (для увеличения вероятности сохранения мутанта);
3. При непрерывном и линейном снижении скорости роста исходного штамма воздействием ингибитора (для наискорейшего выделения мутанта).
Совместить эти, попарно альтернативные условия, можно только динамически, то есть культура микроорганизмов поочерёдно (на некоторое время) должна попадать в каждое из этих условий.
Мутант, даже если он обладает большой скоростью роста, практически не имеет шансов задержатся в ферментере турбидостата. Медленно растущий мутант — тем более. В самом деле, приведенные расчеты это показывают. Посмотрите внимательно график зависимости вероятности сохранения мутанта от скорости роста. Гамма это отношение скорости роста мутанта к скорости роста нормальных клеток. По оси абсцисс время выраженное в делениях клеток.
Рис. 2.6. Вероятность полного отсутствия вымывания делящегося мутанта.
Как тут не упомянуть о пользе математической биологии. Если бы эти расчеты были сделаны до проведения работы, а не после, то и сама работа возможно не была бы проделана. Проходит то время когда биологи рассуждали на пальцах. Позволю себе еще раз процитировать идею автоселекции в турбилостате впервые высказанную Брайсоном и многократно повторенную в работах разных авторов, занимающихся популяционной микробиологией: Для этого предлагалось увеличивать величину ингибирующего фактора в среде, что должно приводить к частичному или полному снижению скорости роста культуры В целом. Вследствие непременного наличия мутантов в популяции, в ферментёре должно появляться какое-то количество клеток способных расти с большей скоростью. Скорость роста культуры в целом при этом увеличится, что может являться основанием для дальнейшего наращивания величины ингибирующего фактора.
Игнорирование числовых (математических) выражений явлений и рассмотрение только качественных приводит к парадоксам типа "Ахиллесчерепаха", в которых спортсмен никогда не сможет догнать даже медленное животное. Конечно, если бы экспериментатор проверял математически каждую пришедшую ему на ум идею, то тогда он целыми днями только бы и сидел за расчетами. Этим должен заниматься отдельный специалист — теоретик, специализирующийся в области биологии.
Выходит что на этой идеи можно ставить точку. Нет, "еще не вечер". Но об этом в следующем, заключительном, разделе.
Часть 3. Патетическая
ПУТИ НЕИСПОВЕДИМЫЕ
Если турбидостат не подходит для целей автоселекции штаммов, то стоит подумать, чем его можно заменить. Тут требуется метод непрерывного культивирования, позволяющий максимально повысить вероятность сохранения мутанта в ферментере. Одним из вариантов может быть применение отъемно-доливного культивирования, упомянутого в книге Перта. Суть его в том, что время от времени часть культуральной среды удаляется их ферментера при постоянном поступлении свежей питательной среды. Если объем ферментера по возможности велик, то слив большей части накопившейся культуральной среды можно производить достаточно редко и появившийся в культуре мутант будет иметь возможность размножится. Конечно, работать с большими объемами в условиях домашней лаборатории довольно затруднительно. Трудно выдержать стерильные условия. Тем не менее, есть одна микробиологическая технология, доступная многим, оперирующая большими объемами и как раз в нестерильных условиях. Это просто домашнее виноделие. Точнее получение этилового спирта в домашних условиях. Очень замечательная технология: результаты даже неудачных опытов всегда можно перегнать на спирт. Есть и подходящая цель экспериментов, изложенная в предыдущей разделе: селекция штаммов дрожжей, производящих по возможности больше алкоголя. Любая удача на этом пути обернется в первую очередь экономией труда и ресурсов, для самого экспериментатора, при перегонке полученного сусла на спирт. Там есть только одна проблема: куда девать полученный спирт. Поскольку речь в данном случае идет о выделении штаммов дрожжей работоспособных при повышенных концентрациях алкоголя в среде, то следует напрочь отказаться от идеи стабилизации, как скорости роста, так и плотности культуры в среде. Тем более что эти идеи на самом деле не работоспособны. В данном случае стабилизировать следует скорость производства спирта. А регулировать ее подачей раствора сахара в ферментер. Ингибитор одновременно является и питательной средой, очень удобно. Размножится в ферментере более устойчивый к спирту и сахару мутант дрожжей, значит, увеличится скорость продукции спирта и можно будет увеличить скорость подачи раствора сахара. Следующий мутант — еще приращение добавления сахара. Технически измерение скорости продукции спирта несложно. Выделение алкоголя дрожжами напрямую связано с выделением углекислого газа. Если выхлоп пропускать через водяной затвор, что, собственно говоря, обычно делается и должно делаться для осуществления брожения, то остается каким либо методом подсчитывать количество прошедших пузырьков газа в единицу времени.
Для этого подойдет, например ячейка для измерения электропроводности воды — проходящий пузырек газа разорвет проводящую цепь. Ферментером может являться большая, литров на 50 стеклянная бутыль или фляга. Компьютер же для управления уже не является проблемой, подойдет даже XT с 8086 процессором.
Итак цели ясны, задачи поставлены, можно попытаться поиграть в эволюцию на лабораторном столе и выяснить самому насколько трудно быть богом. Надеюсь вы не забыли урок изложенный в предыдущем разделе: идея любого эксперимента должна быть по возможности вначале изучена математическими методами. Это добавить ясности в вопросе о том как его проводить и стоит ли вообще его проводить.
Литература:
1. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. (1978)