Страница 80 из 121
Оба приведенные обстоятельства, соединяясь вместе, легко подделывали как бы исчезание того фермента, к которому относили молоко свертывающее действие. Это, очевидно, было причиной того, что у Гамарстена при стоянии искусственного желудочного сока в термостате растворяющее действие оставалось, а свертывающее исчезало, т. е. как бы происходило разделение ферментов. То же видели и мы при этих условиях в натуральном соке, когда мы испытывали его на свертывание после нейтрализации содой.
Ясно, что для исследования обоих действий были взяты методы совершенно различной чувствительности, нисколько между собой ни сопоставленные, ни соразмеренные. Для растворяющего действия применялся большей частью чувствительнейший реагент - фибрин, реагент без какого-либо предела. Для свертывающего действия пользовались нейтрализованным соком, при котором очень быстро с уменьшением количества наступает предел действия, тем более, что авторы брали совершенно произвольно предельное, вообще короткое, время свертывания, очевидно, боясь самопроизвольного подкисления молока. Простой пример бесспорно доказывает это: возьмите крепкий хлебный сок, разбавьте его в несколько сот, даже тысяч раз и вы все же получите довольно быстрое растворение им фибрина - в час, полтора, два. И тот же хлебный сок, нейтрализованный NaHCO3 и разбавленный только в 10-20 раз, даст вам свертывание только после многих часов, а дальше разбавленный не свернет молока и совсем. А между тем очевидно: фермент, свертывающий молоко, никуда исчезнуть из него не мог, не разрушился, и присутствие его там легко можно доказать, сделав благоприятными условия реакции свертывания. Из сказанного ясно, что при правильной методике определения свертывающего действия фермента обязательно повышать чувствительность реакции свертывания, прибавляя или к испытуемым жидкостям, или к молоку вещества, ускоряющие свертывание, как: кислоты, соли кальция, бария и т. д. Конечно, сравниваемые порции испытуемых соков должны быть тщательно уравниваемы в отношении повышающих чувствительность реактивов, самостоятельное, свертывающее действие этих агентов, если таковое существует, должно быть всегда контролируемо. Никакой запутанности из применения такой методики не произойдет, потому что благоприятствующие свертыванию условия действуют, как мы увидим ниже, по определенным правилам. Когда ферментное свертывающее действие в данной среде ослабевает, то усилить это действие только увеличиванием количества жидкости, приливаемой к молоку, удается только до известного предела, потому что рядом с увеличиванием количества фермента в молоке начинает давать себя знать разжижение молока, конечно, резко понижающее способность его свертываться. Когда желудочный сок, стоя в термостате, постепенно разрушается и, нейтрализованный содой, все медленнее свертывает молоко, то сначала вы помогаете делу, увеличивая количество прибавляемого сока к молоку. Но затем, когда вы достигаете трех, четырех куб. см на 10 куб. см молока, этот прием начинает вам отказывать, а в это же время употребление кислого сока в количестве 0.5--1.0 куб. см дает вам свертывание еще в течение нескольких минут или десятков минут. Что в этом случае кислота вас не обманывает, что вы дейстительно имеете перед собой еще ферментное действие, только без кислоты не обнаруживающееся, - это доказывает простейший контрольный опыт. Стоит вам слабый сок нагреть до 70°, to и 1 куб. см его свернет молоко только после десяти часов стояния в термостате, совершенно так, как это сделал бы 1 куб. см 0.5% соляной кислоты.
Третье обстоятельство, недостаточно оцениваемое при методике сравнения молоко свертывающего и белок растворяющего действия различных ферментных препаратов, - это указанное выше задерживающее действие солей и многих других веществ на реакцию растворения белка, отнюдь не простирающееся на молоко свертывающее действие.
Очевидно, на этом обстоятельстве основан главным образом фабричный прием изготовления препаратов сычужного фермента. Одному из нас (И. Павлову) живо припоминается следующее: когда впервые явилась мысль о тождестве химозина и пепсина, профессор Ненцкий возразил против этой мысли фактом, передавая имевшийся у него препарат сычуга из Рижской фабрики и предлагая показать ему в нем пепсинное действие. Жидкости в высшей степени энергично свертывала молоко, но, как мы ее ни подкисляли и ни разжижали (от 2 до 10 раз), фибрин в ней не только не переваривался, но даже уплотнялся.
В то время так и не удалось разрушить это возражение. Только позже, уже после смерти дорогого товарища, оказалось, что задача в данном случае была совсем легкая. Стоило разбавить этот препарат в 100 раз соляной кислотой 0.2%, и он переварил даже яичный вареный белок -- 1.3 мм за 10 часов (Мэтт). Рассчитывая переваривающую силу самого фабричного препарата по правилу Шюца и Борисова, ее надо было определить в 13 мм, что вполне отвечало бы огромное свертывающей силе этого препарата. Что здесь все дело заключается в прибавлении к экстракту сычужного желудка какого-то задерживающего вещества, доказывается следующею вариациею опыта (табл. 14).
То же самое мы получили и на многих других испытанных нами продажных препаратах сычужного фермента, в которых слабое или совсем отсутствующее растворяющее белки действие достигало размера, соответствующего молоко свертывающему действию их, раз только применялся прием надлежащего их подкисления и разжижения.
Надо думать, что, вследствие недостаточной оценки первого и третьего из перечисляемых обстоятельств, и совсем недавно предложенный метод, долженствующий доказать обособленность белок растворяющего и молоко свертывающего проферментов, метод Глэснера [58] отнюдь не достигает цели. Мы многократно применяли этот метод, строжайше следуя указаниям автора, и, однако, ни разу не достигли ни малейшего действительного разделения ферментов. Мы варьировали количество употреблявшихся для образования осадка уксуснокислого уранила и фоссернокислого натра, как только возможно, и имели все степени захватывания фермента осадком. При большом осадке фильтрат от него не обнаруживал никакого действия, зато оба действия оказывались в извлечении из осадка. При небольшом осадке совершенно наоборот. Случаи средних осадков дали все переходы между этими крайностями. Прилагаю таблицу (15).
По нашему мнению, фактически противоречие результатов наших и Глэснера имело свое основание в том, что он, во-первых, в фильтрате не считался с задерживающим действием на реакцию растворения образующегося уксуснокислого натра (см. табл. 6), во-вторых, для свертывающего действия был взят совершенно произвольный и очень ограниченный предел - свертывание литра молока в 30 минут. Представим себе такой случай: пусть с осадком захвачено 43-44 фермента, а в фильтрате осталось или 9/4 3/ его. Уксуснокислый натр почти совершенно мешает обнаружиться растворяющему действию фермента, так что проявляется только одно молоко свертывающее действие. Извлеченный из осадка фермент, благодаря разбавлению извлекающею жидкостью, освободился из-под влияния уксуснокислого натрия, т. е. снова стал растворять белок в значительной степени. Молоко же свертывающее действие экстракта, вследствие значительного разжижения, оказалось за пределами данной методики.
Точно таким же образом при точной проверке оказался недостигающим цели и второй метод Гамарстена. Он, как известно, начинается с многократного взбалтывания искусственного сока с порошком углекислого магния, при этом, по автору, пепсин должен был из жидкости увлекаться порошком, а химозин оставаться в жидкости, и затем следовала дальнейшая процедура очищения химозина. Мы проделали первую фазу методики с натуральным желудочным соком и видели то, что было перед глазами у Гамарстена. Фильтрат (3-й, 4-й и 5-й), хотя и меньше нормальной жидкости, но все же значительно быстро свертывал молоко, между тем как подкисленный до нормальной кислотности (0.5) без разжижения или только при малом разжижении совершенно не переваривал сырого фибрина даже за целые сутки. Однако стоило только разбавить фильтрат в 5-10 раз кислотой 0.1-0.2 для того, чтобы растворяющее действие фибрина обнаружилось совершенно отчетливо. И сколько раз мы ни взбалтывали наш предварительно нейтрализованный сок с углекислым магнием, мы не могли получить такого фильтрата, который при указанных условиях был бы лишен растворяющего действия на фибрин. Таким образом исчезнувший было параллелизм обоих действий для нас восстановился и мы было сочли себя удовлетворенными. Впоследствии, когда мы вместо параллелизма стали настаивать на пропорциональности, хотя бы приблизительной, этот пункт представил нам огромные затруднения и вызвал было даже в нас горькие сомнения относительно основного нашего положения, хотя это было в конце длиннейшего ряда фактов, нами полученных и до тех пор нам благоприятных. Когда мы попробовали более точно сопоставить молоко свертывающее и белок растворяющее действие фильтрата после взбалтывания с углекислым магнием, мы не могли не видеть огромной непропорциональности в обоих действиях. В то время как молоко свертывающее действие фильтрата указывало на уменьшение фермента в несколько раз, самое большее - в несколько десятков раз, по белок растворяющему действию фермента в жидкости оставалось в несколько сот и даже тысяч раз меньше. Мы обратили внимание на все мыслимые для нас обстоятельства. Мы определили и устранили задерживающее влияние на растворение того хлористого натрия, который образовался при нейтрализации сока. Мы определили и приняли во внимание благоприятствующее свертыванию молока действие того небольшого количества углекислого магния, которое растворялось в нашей жидкости при взбалтывании. Мы испробовали всякие степени кислотности, но факт в общем оставался прежним. Указанные меры изменяли результат только очень незначительно. Однако при этом постепенно накоплялись наблюдения, направлявшие мысль в надлежащий пункт. Титруя последовательные фильтраты, мы заметили, что их щелочность (вследствие небольшого растворения углекислого магния с щелочной реакцией) постепенно возрастает до известного предела, а с нею вместе понижалось белок растворяющее действие фильтрата. Это наводило на мысль: не играет ли в данном случае роль именно щелочность фильтрата? Поэтому прежде всего мы обратились к осадку углекислого магния после взбалтывания: действительно ли с ним увлечен из жидкости пепсин? Растворив этот осадок в соляной кислоте, разжижив его в надлежащей степени, чтобы устранить задерживающее действие хлористого магния, и подкислив соответственно, мы легко и точно на многих опытах убедились, что значительного захватывания пепсина осадком не происходило. Полученный раствор обнаруживал ничтожные следы растворяющего и молоко свертываютего действия, сравнительно с фильтратом. Стало действительно ясно, что механизм наблюдавшихся явлений в первой фазе гамарстеновского метода совершенно не тот, каким его представляли до сих пор. Это было давно известное разрушение фермента щелочью, разрушение или какое-то химическое изменение фермента под влиянием щелочи. Но если свойства фильтрата и были результатом действия щелочи, то все же, ввиду факта расхождения наших действий в фильтрате, приходилось думать так, что щелочь сильнее разрушает фермент, растворяющий белок, чем фермент, свертывающий молоко. Однако, принимая во внимание некоторые особенности, бросившиеся нам в глаза, когда мы занимались опытами с разрушающим действием щелочей на ферменты желудочного сока, мы продолжали стоять на своей точке зрения и старались добиться восстановления пропорциональности между обоими действиями, которая нам так упрямо не давалась. Наконец наше упорство было награждено: при, повидимому, совершенно ничего не значащей вариации опыта наш фильтрат проявил, наконец, растворяющее белки действие, нисколько не меньшее, а скорее большее, чем какое можно было ожидать на основании его молоко свертывающего действия. До сих пор мы Фильтрат, сделавшийся щелочным от взбалтывания с углекислым магнием, для переваривания сразу делали кислом до известной степени. Теперь же мы сперва его только нейтрализовали, таким оставляли стоять некоторое время и лишь затем подкислили до той же степени. И в этом-то фильтрате обнаружилось давно желанное значительное растворяющее действие (табл. 16).