Трещина в мироздании

В этой части исследования Danisco не было ничего принципиально нового, поскольку другие ученые тоже использовали сходные методы для обнаружения резистентных к фагам штаммов S. thermophilus. Но Родольф и Филипп пошли дальше. Они попытались выяснить, что именно на уровне генов обеспечивает бактериям эту наблюдаемую неуязвимость.

У Родольфа и Филиппа была одна догадка по поводу того, какая часть бактериального генома делала мутировавшие штаммы S. thermophilus устойчивыми к заражению вирусами: они подозревали, что за это отвечает CRISPR, и предполагали, что участки CRISPR у девяти новых мутантных штаммов по строению отличаются от таковых у предкового штамма. И действительно: выделив геномную ДНК из каждого мутантного штамма, исследователи обнаружили, что каждая область с CRISPR расширилась за счет вставки новых кусочков ДНК между повторами. Более того, эти новые спейсеры точно повторяли последовательности ДНК фага, к которому конкретный штамм приобрел иммунитет. Особенно примечательным казалось следующее: благодаря физическому встраиванию в область CRISPR бактериальной ДНК новоприобретенная устойчивость наследовалась и могла передаваться всем последующим поколениям при каждом делении.

Исследователи из Danisco обнаружили еще один способ борьбы бактерий с вирусами – их пятый набор вооружения. Как мы теперь знаем, в дополнение к ранее открытым системам защиты у бактерий имеется (в виде CRISPR) удивительно эффективная система противовирусного адаптивного иммунитета, позволяющая “воровать” кусочки ДНК фагов, когда последние заражают бактерии, и использовать их для обеспечения иммунного ответа в будущем. По выражению Блейка, CRISPR работал как “молекулярная карта” профилактических прививок: сохраняя память о предыдущих фаговых инфекциях в форме спейсерных последовательностей ДНК, запрятанных в рядах из повторов и спейсеров, бактерии могли использовать эту информацию для распознавания и разрушения тех же самых фагов во время новых столкновений с ними.

CRISPR: молекулярная карта профилактических прививок

С момента публикации исследования Danisco малопонятная биология CRISPR начала привлекать внимание исследователей. Кроме того, эта статья стала поводом для проведения первой посвященной CRISPR встречи, которая состоялась в Калифорнийском университете в Беркли в 2008 году и была организована Джилл Бэнфилд и Родольфом Баррангу. Однако, как это всегда бывает в науке, исследователи приоткрыли одну дверь, чтобы обнаружить за ней другую. Поскольку для иммунного ответа CRISPR требуется, чтобы последовательности ДНК в вирусном и бактериальном геноме полностью совпадали, было понятно, что эта иммунная система “целится” в генетический материал фагов, чтобы разрушить его, – но как? Какая составляющая клетки наводилась на цель?

Прошло не так уж много времени, и начал вырисовываться ответ и на этот вопрос. Стэн Броунс, постдок из лаборатории Джона ван дер Ооста в Вагенингенском университете в Нидерландах, предоставил убедительное доказательство того, что молекулы РНК задействованы в основанной на CRISPR защите от вирусов[63]. Стэн опирался на более раннее исследование, в ходе которого были обнаружены молекулы РНК, в точности совпадающие с последовательностью ДНК CRISPR в клетках архей различных видов[64] (включая обитающие в вулканах штаммы Sulfolobus, которых изучал Блейк). Это позволило предположить, что РНК может координировать в иммунном ответе стадии распознавания и разрушения фагов. А Стэн, экспериментируя с E. coli, добавил к этим наблюдениям новые сведения, подтвердив, что РНК играет эту роль в основанной на CRISPR системе защиты у совершенно иного микроорганизма, – и это послужило хорошим аргументом в пользу того, что РНК необходима для всех связанных с CRISPR иммунных систем.

Стэн также показал, каким образом в клетке синтезируются молекулы РНК CRISPR. Сначала бактериальная клетка “переводит” весь ряд элементов CRISPR в длинные цепочки РНК, с точностью до буквы совпадающие с последовательностью нуклеотидов в ДНК CRISPR (как мы помним, РНК – молекула-сестра ДНК, состоящая из тех же “букв”, с той только разницей, что “буква” Т в ДНК в РНК заменяется на У). Как только клетка синтезирует эти длинные цепочки РНК на основе CRISPR, фермент с хирургической точностью разрезает их на более короткие РНК одинаковой длины, единственное отличие между которыми – последовательности нуклеотидов в их спейсерах. В ходе этого процесса длинные повторяющиеся последовательности ДНК переводятся в библиотеку из более коротких молекул РНК, каждая из которых содержит одну последовательность, построенную на основе фрагмента генома конкретного фага.

Эти данные указали на ключевую роль, которую РНК CRISPR играет в бактериальной иммунной системе, – и для этой роли РНК идеально подходит. Поскольку РНК химически очень похожа на ДНК, она также может образовывать двойные спирали за счет комплементарных взаимодействий азотистых оснований (которые лежат и в основе знаменитой двойной спирали ДНК)[65]. Подходящие (комплементарные) цепочки РНК могут взаимодействовать друг с другом, формируя двойную спираль РНК – РНК, но и одна цепочка РНК способна соединяться с подходящей одиночной цепочкой ДНК с образованием двойной спирали РНК – ДНК. Эта вариабельность и многообразие последовательностей, обнаруженных в РНК CRISPR, подсказали ученым заманчивую идею. Казалось возможным, что молекулы РНК CRISPR способны “вывести из игры” ДНК и РНК фагов-интервентов, образуя пары с любыми из них, подходящими по последовательности нуклеотидов, и запуская в клетке некий иммунный ответ.

Если РНК в самом деле помогает таким образом “целиться” в генетический материал вирусов, то механизм CRISPR, видимо, действительно похож на механизм РНК-интерференции, который изучали в моей лаборатории, – как и предполагали авторы той статьи, которая и “подсадила” меня на изучение CRISPR! При РНК-интерференции в клетках растений и животных для разрушения вирусов-интервентов образуются двойные спирали РНК – РНК. Вероятно, весьма похожим образом – используя двойные цепочки РНК – РНК, молекулы РНК CRISPR атакуют фаговые РНК в ходе иммунного ответа. Я была очарована открывавшейся здесь дополнительной возможностью: в отличие от РНК-интерференции, молекулы РНК в механизме CRISPR были способны распознавать и комплементарную ДНК – и благодаря этому “CRISPR-оружие” могло атаковать вирусные геномы по двум фронтам сразу.

Вскоре после открытия Стэна два исследователя из Северо-Западного университета – Лучано Марраффини и его наставник Эрик Сонтхаймер (с которым мы были знакомы еще со времен, когда он учился в Йеле) – выяснили, что РНК CRISPR действительно способна управлять процессом разрушения ДНК. Работая с еще одним микроорганизмом под названием Staphylococcus epidermidis – сравнительно безобидной бактерией с поверхности кожи человека (но близкой родственницей опасного и устойчивого к антибиотикам штамма золотистого стафилококка Staphylococcus aureus), Лучано спланировал серию элегантных экспериментов, чтобы доказать, что РНК CRISPR нацеливается на ДНК генетических паразитов-вторженцев[66]. Он также показал, что это наведение на цель, скорее всего, производится за счет комплементарных взаимодействий азотистых оснований – единственного процесса, способного обеспечить специфичность, с которой CRISPR уничтожал свою жертву.

Скорость и тщательность проведения этих исследований захватывали дух. Всего за несколько лет после моего знакомства с механизмом CRISPR его изучение из россыпи интересных, но мало что объясняющих работ переросло во всеобъемлющую единую теорию устройства и работы системы приобретенного (адаптивного) иммунитета микроорганизмов. Эта теория была основана на непрерывно растущем множестве экспериментальных исследований, и, хотя к концу двухтысячных было уже опубликовано немало фундаментальных статей, было очевидно, что всем нам предстоит проделать еще больший объем работы, чтобы действительно разобраться в этой мудреной бактериальной системе защиты.

63

S. J. J. Brouns et al., “Small CRISPR RNAs Guide Antiviral Defense in Prokaryotes”, Science 321 (2008): 960–964.

64

T.-H. Tang et al., “Identification of Novel Non-Coding RNAs as Potential Antisense Regulators in the Archaeon Sulfolobus solfataricus”, Molecular Microbiology 55 (2005): 469–481.

65

Но это происходит гораздо реже, чем в случае ДНК, из-за разницы в сахарах. В каждом нуклеотиде РНК содержится сахар рибоза, и у нее по сравнению с дезоксирибозой ДНК один атом кислорода “лишний”. Именно он затрудняет образование двойных спиралей РНК.

66

L. A. Marraffini and E. J. Sontheimer, “CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA”, Science 322 (2008): 1843–1845.