Страница 7 из 21
Поскольку в ходе реакции образуется множество копий исходной молекулы ДНК, а обрыв цепи происходит случайным образом, в конце реакции получается набор молекул, обрывающихся на
ка
каж
кажд
каждой
каждой б
каждой бу
каждой бук
каждой букв
каждой букве
каждой букве (исходной последовательности).
Таким образом, секвенирование ДНК представляет собой воспроизведение исходной матрицы. Вы создаете миллионы копий разной длины, оканчивающиеся абсолютно на каждой букве исходной последовательности. Дальше нужно расположить эти фрагменты в порядке увеличения длины. Молекулы ДНК несут отрицательный заряд и поэтому, если вы поместите их в солевой раствор и подключите напряжение, ДНК будет двигаться к положительному электроду. Скорость перемещения зависит от массы фрагмента (от его длины): длинные фрагменты движутся медленнее, короткие быстрее. Если же вы поместите фрагменты ДНК не в солевой раствор, а в гель, и включите электрический ток, фрагменты ДНК разделятся в геле в соответствии с размером.
Но для проведения реакции нужно учесть еще кое-что. В ДНК всего четыре буквы (а не 26, как в английском языке), поэтому исходную ДНК нужно поместить в четыре пробирки. В каждую пробирку нужно внести все ингредиенты, но, кроме того, в первую добавить немного измененных оснований A, которые останавливают реакцию, когда в матрице встречаются основания A. Во вторую пробирку нужно внести все ингредиенты плюс небольшое количество останавливающих реакцию оснований C. То же самое с оставшимися пробирками для оснований T и G. Когда реакция завершается, у вас имеется одна пробирка, в которой все фрагменты заканчиваются на A, вторая пробирка с окончанием фрагментов на C, третья с окончанием на T и четвертая с окончанием на G. Если вы нанесете содержимое этих пробирок в четыре соседние лунки в геле и подключите напряжение, фрагменты разделятся в зависимости от размера, и вы сможете определить положение каждой буквы в исходной молекуле ДНК.
Например, первая колонка может выглядеть так:
*****AA**A*****A******A*A***A*
Вторая так:
**T*T**T**T*T*T*T*T*T****T*T**
Третья так:
C**C****C**C*********C*C**C**C
И четвертая так:
*G*********G*G**********
И если вы наложите друг на друга эти последовательности, то получите исходный фрагмент:
CGTCTAATCATCTGTATGTGTCACATCTAC
Если вы когда-нибудь видели по телевизору ученых с длинными листами с изображением множества черных полосок, расположенных ровными колонками, значит, вы видели именно это. Это последовательность букв в ДНК из наших клеток, которую мы не могли прочесть на протяжении четырех миллиардов лет, но теперь можем определить за считаные минуты и недорого. За изобретение этого замечательного способа чтения последовательностей ДНК Сенгер совершенно заслуженно получил свою вторую Нобелевскую премию по химии в 1980 году[10].
В 1990-х годах, когда в рамках проекта «Геном человека» предстояло определить последовательность трех миллиардов букв человеческого генома, метод Сенгера был видоизменен и автоматизирован. В главе 5 будет говориться о том, почему работа над проектом была столь сложной, и почему для ее выполнения потребовалось так много времени и денег. В 1990-х годах я был студентом и отправлял короткие фрагменты очищенной ДНК на анализ в специализированную лабораторию, занимавшуюся секвенированием, и несколько дней ждал результатов (не в виде красивых фотографий, а в виде компьютерных файлов). Теперь большинство генетических лабораторий имеют собственные приборы (секвенаторы) и за несколько часов считывают мегабайты информации. Появились новые технологии, которые не вытеснили метод Сенгера полностью, но позволили работать быстрее и с меньшими затратами, и если вы начинаете карьеру генетика в наши дни, возможно, вы лично никогда не воспользуетесь методом Сенгера. Уже существуют секвенаторы размером с колоду карт, которые подключаются к переносному компьютеру через USB, так что вы можете брать их с собой для полевых исследований и секвенировать геномы растений и животных прямо на природе. Все эти нововведения стимулируют революцию в генетике, которая коснется всех нас. К примеру, мы уже научились анализировать ДНК давно умерших людей.
В земле лежал давным-давно умерший человек. Может быть, его тело положили сюда родственники, или он здесь и умер, не подозревая, что станет одним из самых важных людей за всю историю человечества. Спустя много-много лет после смерти этот человек сделал две вещи. Прежде всего, обнаружение его костей в 1856 году стало толчком к изучению древних людей. Он жил на территории современной Германии, в долине Неандер, примерно 40 тысяч лет назад. Пещеры Фельдхофер, где нашли кости, больше не существует: она была разрушена при строительстве каменоломни.
Зато сохранились описания. Вход в пещеру находился на несколько метров выше уровня земли: узкий лаз вел в каменную комнату размером примерно три на пять метров, с высоким потолком. В этом месте археологами-любителями, а потом и профессионалами были обнаружены тысячи артефактов, включая останки как минимум трех человек. В уже упомянутом 1856 году рабочие каменоломен обнаружили несколько окаменелых костей: фрагмент черепа размером с подставку под пивную кружку, две бедренные кости, несколько костей рук (больше, чем нужно одному человеку), а также фрагменты лопаток и ребер; все это они отнесли местному антропологу.
Останки человека, не относящегося к виду Homo sapiens, были обнаружены не впервые (кажется, это был третий подобный экземпляр), однако они оказались «типичными»: именно они определили признаки вида, и именно с ними стали сравнивать все следующие находки. Название вида: Homo neanderthalensis, как вы уже поняли, связано с этим типичным образцом. Возможно, у этого человека было имя при жизни, но для нас он стал Неандертальцем 1 (Neanderthal 1). С его формальной идентификацией связано начало развития палеоантропологии – науки о древних людях.
Но это еще не все. Второй революционный переворот Неандерталец 1 совершил еще через 150 лет. Он предоставил ученым свою ДНК. В холодной пещере его останки в какой-то степени были защищены от хищных животных и всепожирающих бактерий, которые в других условиях уничтожили бы все следы его существования. В этом необычном убежище кости оставались нетронутыми на протяжении сорока тысяч лет. В результате в 1997 году Неандерталец 1 стал первым членом закрытого клуба людей, не относящихся к виду Homo sapiens. Внутри медленно разрушающихся клеток его руки, которой он, возможно, метал копье, были обнаружены молекулы наследственности, несущие свое послание из прошлого в будущее.
В рамках проекта «Геном человека» был исследован геном не только современных людей. Возможно, вам это покажется странным, но изначально в задачи проекта было заложено изучение шести видов существ. Геном раскрывает гораздо больше информации, если его сравнить с другим геномом, в том числе, с геномом организма другого вида. По этой причине в «геномный клуб», кроме нас, вошли следующие существа: любимые модельные организмы ученых – фруктовая муха Drosophila melanogaster, крыса и мышь; затем наши ближайшие родственники шимпанзе; затем медоносная пчела (по той причине, что она является социальным животным; кроме того, большинство членов пчелиной семьи вообще не участвуют в производстве потомства, а только служат королеве, с которой разделяют ровно половину своей ДНК). Геномы этих существ уже были прочитаны и расшифрованы в конце XX века.
10
Первую Нобелевскую премию Фредерик Сенгер получил в 1958 году за определение аминокислотной последовательности инсулина. До настоящего момента он остается единственным человеком, получившим премию по химии дважды, и одним из четырех людей, дважды удостоенных этой премии в любой номинации. Сенгер умер в то время, пока я писал эту книгу (19 ноября 2013 г.), но его будут помнить благодаря изобретенным им технологиям, и его именем назван институт геномных исследований The Wellcome Trust Sanger Institute вблизи Кембриджа, расположенный неподалеку от того места, где он жил. Это один из важнейших мировых научных центров.
11
Первая строка стихотворения валлийского поэта Дилана Томаса (1914–1953): And death shall have no dominion.