Страница 25 из 34
Лаборатория P4 – ультразащищенный комплекс, в котором ведутся биохимические исследования смертельно опасных организмов, например вируса лихорадки Эбола, а также разрабатывается биологическое оружие. В конце 1970-х годов в лаборатории P4 также работали ученые, исследовавшие человеческую ДНК методами генной инженерии
Глава 4
Подобные Богу: работа над молекулой ДНК
Молекула ДНК невероятно длинная. В любой хромосоме присутствует всего одна непрерывная двойная спираль ДНК. Когда требуется «популярно» объяснить масштабность этой молекулы, нуклеотидную наполненность ДНК сравнивают с количеством записей в телефонном справочнике Нью-Йорка или с длиной Дуная. Мне такие сравнения ни о чем не говорят – я не знаю, сколько номеров в телефонной книге Нью-Йорка, а Дунай ассоциируется у меня скорее с вальсами Штрауса, а не с какой-то линейной дистанцией.
Все человеческие хромосомы (кроме половых: X и Y) нумеруются в зависимости от размера. Хромосома 1 – самая крупная, а хромосомы 21 и 22 – мельчайшие. На хромосому 1 в каждой клетке приходится 8 % ДНК, примерно четверть миллиарда пар оснований. В хромосомах 21 и 22 содержится соответственно 48 и 51 миллион пар оснований. Даже в самых маленьких молекулах ДНК (у вирусов маленьких размеров) как минимум несколько тысяч пар оснований.
На заре молекулярной биологии огромные размеры молекулы ДНК представляли серьезную проблему. Чтобы разобраться с тем или иным геном, то есть конкретным отрезком ДНК, нужно было каким-то образом отделить его от всей остальной ДНК, которая простирается по обе стороны от этого гена. Но этим дело не ограничивалось: ген нужно было не только выделить, но и, так сказать, увеличить: получить настолько крупный фрагмент гена, чтобы с ним можно было работать. В сущности, нам требовался инструмент для молекулярного редактирования – пара молекулярных ножниц, которые позволяли бы кроить текст ДНК, получая удобоваримые фрагменты. Нужен был молекулярный клей, чтобы соединять полученные фрагменты, и, наконец, молекулярная «копировальная машина» для увеличения нарезанных и выделенных нами молекулярных фрагментов. Мы хотели делать примерно то, что сегодня позволяет делать современный текстовый редактор: вырезать, копировать и вставлять кусочки ДНК.
Разработка базовых инструментов для таких процедур казалась отчаянно сложной задачей даже после расшифровки генетического кода. Однако после ряда открытий, сделанных в конце 60-х – начале 70-х годов, для нас словно «звезды сошлись»: в 1973 году появилась так называемая технология рекомбинантных ДНК, что дало возможность редактировать ДНК. Это был не просто прорыв в методах молекулярной биологии. Ученые разом обрели инструмент для адаптации молекул ДНК к потребностям исследователя путем создания таких ДНК, которых никогда не существовало в природе. Мы смогли опробовать себя в роли Бога, экспериментируя с молекулярной основой самой жизни. Такая идея многим казалась некорректной. Так, всегда настороженный и остро реагирующий на любые новаторские идеи Джереми Рифкин, которому каждая новая генетическая технология казалась скользкой дорожкой к созданию монстра, наподобие Франкенштейна, очень верно отметил, что «технология рекомбинантной ДНК может поспорить по значимости с приручением огня».
Артур Корнберг первым «создал жизнь» в пробирке. Как мы уже знаем, в 1950-е годы он открыл ДНК-полимеразу, фермент, обеспечивающий репликацию ДНК и выстраивающий комплементарную копию из расплетенной исходной нити. Позже, работая с вирусной ДНК, он наконец смог осуществить репликацию всех 5300 пар оснований ДНК этого вируса. Однако полученный продукт не был «живым»: несмотря на то что последовательность оснований ДНК не отличалась от исходной, молекула была биологически инертна. Чего-то не хватало. Это недостающее звено удалось найти лишь в 1967 году, причем это одновременно сделали Мартин Геллерт из Национальных институтов здравоохранения и Боб Леман из Стэнфорда. Фермент назвали лигазой. Лигаза позволяет склеивать концевые участки молекул ДНК.
Артуру Корнбергу удалось реплицировать вирусную ДНК при помощи ДНК-полимеразы, а добавив фермент лигазу, он сформировал из ДНК непрерывный контур, как это и было устроено в «подопытном вирусе». Теперь «искусственная» вирусная ДНК вела себя точно так же, как и исходная вирусная: обычный вирус размножается в E. coli, и ДНК, выведенная Корнбергом in vitro, вела себя точно так же. Воспользовавшись лишь парой ферментов, простейшими химическими ингредиентами и вирусной ДНК, с которой была снята копия, Корнберг синтезировал биологически активную молекулу. Средства массовой информации тут же сообщили, что Корнберг создал «жизнь в пробирке», а президент Линдон Джонсон назвал этот прорыв «ошеломительным достижением».
Вклад Вернера Арбера в разработку технологии рекомбинантной ДНК, сделанный в 1960-е годы, был не столь предсказуемым. Швейцарский биохимик Вернер Арбер интересовался не грандиозными вопросами о молекулярной природе жизни, а загадочными аспектами эволюции вирусов. Он изучал процесс, в ходе которого некоторые вирусные ДНК деградировали после внедрения в бактериальные клетки. Некоторые клетки-хозяева (но не все – иначе вирусы не могли бы воспроизводиться) распознавали вирусные ДНК как чужеродные тела и избирательно атаковали их. Но как – и почему? Все ДНК в природе – это разновидности одной и той же молекулы, кому бы они ни принадлежали: бактериям, вирусам, растениям или животным. Почему бактерия не атакует собственную ДНК так же, как вирусную?
Первые ответы на поставленные вопросы появились после того, как Арбер открыл новую группу ферментов, расщепляющих ДНК, – так называемые рестриктазы. Они присутствуют в бактериальных клетках и подавляют размножение вирусов, разрезая на фрагменты чужеродную ДНК. Такое разрезание ДНК – это специфическая реакция на конкретные последовательности: фермент разрезает нить ДНК, лишь если обнаружит в ней искомую последовательность. EcoRI была одной из первых открытых рестриктаз – она находит и обрезает нить оснований ГААТТЦ[3].
Однако почему бактерия при этом не обрезает собственную ДНК везде, где в ней встречается последовательность ГААТТЦ? Здесь Арбер совершил второе великое открытие. Бактерия синтезирует не только рестриктазу, нацеленную на конкретные последовательности, но и второй фермент, химически модифицирующий те самые последовательности в собственной ДНК, как только они ему попадаются[4]. Измененные таким образом последовательности ГААТТЦ, присутствующие в бактериальной ДНК, не привлекают рестриктазу EcoRI, даже когда фермент словно катком проносится по клетке, повсюду разрезая замеченные вирусные ДНК. Защита бактериального генома от собственной рестриктазы осуществляется с помощью метилирования нуклеотидных остатков аденина и цитозина и называется маскированием.
В основе следующего этапа революции в молекулярной биологии, связанной с рекомбинантной ДНК, было изучение развития у бактерий антибиотикорезистентности. В 1960-х годах выяснилось, что у многих бактерий такая резистентность возникает не по стандартной схеме через мутацию бактериального генома, а путем импорта так называемой плазмиды: это небольшие молекулы ДНК, находящиеся внутри бактерии, физически отдельные от геномных хромосом и способные реплицироваться автономно и передаваться потомству вместе с остальным бактериальным геномом при делении клеток. В некоторых случаях бактерии сами могут обмениваться плазмидами, и в таком случае бактерия-получатель приобретает «информационный набор», которого у нее не было «при рождении». Таким образом, плазмиды служат средством горизонтального переноса генов. В передаваемом информационном комплекте часто имеются гены, как раз и обеспечивающие резистентность к антибиотикам. Естественный отбор у бактерий, работающий в направлении антибиотикорезистентности, благоприятствует тем клеткам, у которых имеется плазмидный фактор антибиотикоустойчивости.
3
Этот мотив, как и большинство последовательностей в рестриктазах, является палиндромом, то есть комплементарная последовательность оснований с противоположного конца читается точно так же: ГААТТЦ.
4
Вот как происходит такая химическая модификация: фермент добавляет к основаниям метильные группы CH3.